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[Reimpresión] Introducción a los principios de la tecnología de secuenciación del genoma de tercera generación

A partir de 1977, la primera generación de tecnología de secuenciación de ADN (método Sanger) [1] se ha desarrollado durante más de 30 años, y la tecnología de secuenciación ha logrado grandes avances. Desde la primera generación hasta la tercera generación o incluso la cuarta generación, la longitud de lectura de la secuencia aumenta de larga a corta y luego de corta a larga. Aunque a juzgar por la situación actual, las tecnologías de secuenciación de lectura corta y larga de segunda generación todavía ocupan una posición absolutamente dominante en el mercado global de secuenciación, las tecnologías de secuenciación de tercera y cuarta generación también se han desarrollado rápidamente en los últimos dos años. . Cada cambio en la tecnología de secuenciación también ha promovido en gran medida los campos de la investigación del genoma, la investigación médica de enfermedades, la investigación y el desarrollo de fármacos, el mejoramiento genético y otros campos. Aquí haré principalmente un breve resumen de la tecnología de secuenciación actual y sus principios de secuenciación.

La rápida adquisición de información genética de la vida es de gran importancia para la investigación en ciencias de la vida. La Figura 1 arriba (haga clic derecho en la imagen para ver la imagen más grande, la misma a continuación) describe el desarrollo de toda la tecnología de secuenciación desde que Watson y Crick establecieron la estructura de doble hélice del ADN en 1953.

Tecnología de secuenciación de primera generación

La tecnología de secuenciación de ADN de primera generación utiliza el método de terminación de cadena o la combinación infinita y el método de Gilbert iniciado por Sanger y Coulson en 1975 El método químico (cadena degradación) inventado en 1976-1977 se completó en 1977. Desde entonces, los humanos han adquirido la capacidad de indagar en la naturaleza de las diferencias genéticas en la vida y han entrado en la era de la genómica. Los investigadores han seguido mejorando el método Sanger a lo largo de los años. En 2001, se completó el primer mapa del genoma humano basado en un método Sanger mejorado. El principio central del método Sanger es que, dado que ni 2' ni 3' del ddNTP contienen grupos hidroxilo, no se pueden formar enlaces fosfodiéster durante la síntesis de ADN, por lo que se puede utilizar para interrumpir la reacción de síntesis de ADN. Agregue una cierta proporción de ddNTP marcados con radioisótopos (incluidos ddtp, ddCTP, ddGTP y ddTTP) a los cuatro sistemas de reacción de síntesis de ADN. Después de la electroforesis en gel y la autorradiografía, se puede determinar la posición de la banda electroforética para probar. la molécula (Figura 2). Este sitio web hizo un video corto sobre el método de secuenciación de Sanger, que es vívido.

Cabe destacar que en las primeras etapas del desarrollo de la tecnología de secuenciación, además del método Sanger, también aparecieron algunas otras tecnologías de secuenciación, como la pirosecuenciación, los métodos de ligasa, etc. Entre ellos, la pirosecuenciación es un método de secuenciación utilizado posteriormente por la tecnología 454 de Roche2-4, y la secuenciación de ligasa es un método de secuenciación utilizado posteriormente por la tecnología de fase sólida de ABI2-4, pero su método principal común es el dNTP, que puede interrumpir la reacción de síntesis del ADN de Sanger1. .

Tecnología de secuenciación de segunda generación

En general, la característica principal de la tecnología de secuenciación de primera generación es que la longitud de lectura de secuenciación puede alcanzar los 1000 pb y la precisión llega al 99,999%. Sin embargo, sus deficiencias, como el alto costo de secuenciación y el bajo rendimiento, afectan seriamente su aplicación real a gran escala. Por tanto, la tecnología de secuenciación de primera generación no es el mejor método de secuenciación. Tras un continuo desarrollo y mejora tecnológica, nació la tecnología de secuenciación de segunda generación marcada por la tecnología 454 de Roche, Solexa de Illumina, la tecnología Hiseq y la tecnología Solid de ABI. La tecnología de secuenciación de segunda generación ha reducido considerablemente los costos de secuenciación, al mismo tiempo que ha aumentado considerablemente la velocidad de secuenciación y mantiene una alta precisión. Solía ​​tomar tres años completar la secuenciación de un genoma humano, pero solo toma una semana usando la tecnología de secuenciación de segunda generación, pero la longitud de lectura de la secuencia es mucho más corta que la de la tecnología de secuenciación de primera generación. La Tabla 1 y la Figura 3 comparan brevemente las características de la tecnología de secuenciación de primera generación y el costo de la secuenciación de segunda generación. 5. Presentaré brevemente los principios y características principales de estas tres tecnologías principales de secuenciación de segunda generación.

Illumination

Se debe decir que Solexa y Hiseq de Illumina son las máquinas secuenciadoras de segunda generación más utilizadas en el mundo. Los principios técnicos básicos de estas dos series son los mismos. Estas dos series de máquinas adoptan un método de clasificación mientras sintetizan. El proceso de clasificación se divide principalmente en los siguientes cuatro pasos, como se muestra en la Figura 4.

? (1) Construcción de la biblioteca de ADN que se va a analizar

En la actualidad, además del ensamblaje y otros requisitos especiales, la tarea principal es fragmentar la muestra de ADN que se va a analizar en fragmentos de secuencias diferentes de 200 a 500 pb de largo. Se añaden adaptadores a cada extremo para construir una biblioteca de ADN monocatenario.

? (2) Celda de flujo

La celda de flujo es un canal para adsorber fragmentos de ADN que fluyen.

Cuando se construyen bibliotecas, el ADN de estas bibliotecas se adhiere aleatoriamente a los canales en la superficie de la celda de flujo a medida que pasa a través de la celda de flujo. Cada celda de flujo tiene 8 canales y hay muchos adaptadores adheridos a la superficie de cada canal, que se pueden emparejar con los adaptadores agregados en ambos extremos de los fragmentos de ADN durante el proceso de construcción de la base de datos (es por eso que la celda de flujo puede adsorber los ADN después de la construcción de la base de datos), y puede soportar la amplificación por PCR del ADN en su superficie.

? (3) Amplificación y desnaturalización por PCR en puente

La PCR en puente utiliza el adaptador fijado en la superficie de la celda de flujo como plantilla para realizar la amplificación en puente, como se muestra en la Figura 4. R. Después de ciclos repetidos de amplificación y desnaturalización, cada fragmento de ADN eventualmente se concentrará en su propia posición en haces, y cada haz contendrá muchas copias de una única plantilla de ADN. El propósito de este proceso es amplificar la intensidad de la señal de las bases para cumplir con los requisitos de señal de la secuenciación.

(4) Secuenciación

El método de secuenciación adopta el método de secuenciación mientras se sintetiza. Al mismo tiempo se añaden al sistema de reacción ADN polimerasa, cebadores adaptadores y 4-dNTP marcados con fluorescencia específicos de bases (como la secuenciación de Sanger). Los 3'-OH de estos dNTP están protegidos químicamente, por lo que sólo se puede agregar un dNTP a la vez. Después de agregar dNTP a la cadena sintética, todos los dNTP libres y la ADN polimerasa no utilizados se eliminarán por lavado. Luego agregue el tampón necesario para excitar la fluorescencia, use un láser para excitar la señal de fluorescencia y use equipo óptico para registrar la señal de fluorescencia. Finalmente, la señal óptica se convierte en bases de secuenciación mediante análisis informático. Después de registrar la señal de fluorescencia, agregue reactivos químicos para apagar la señal de fluorescencia y elimine el grupo protector dNTP 3'-OH para el siguiente paso de la reacción de secuenciación. La tecnología de secuenciación de Illumina solo agrega un dNTP a la vez, lo que puede resolver el problema de medir con precisión la longitud de los homopolímeros. La principal fuente de errores de secuenciación es la sustitución de bases. Su tasa de error de secuenciación actual está entre el 1% y el 1,5%. Tomando como ejemplo la resecuenciación del genoma humano, la profundidad de secuenciación de 30x es de aproximadamente 1 semana.

Roche 454

El sistema de secuenciación Roche 454 es la primera plataforma para la operación comercial de la tecnología de secuenciación de segunda generación. El principio principal de secuenciación es (Figura 5 abc) 2:

(1) Preparación de la biblioteca de ADN

El método de construcción de archivos del sistema de secuenciación 454 es diferente del de Illumina. Fragmenta el ADN a analizar en pequeños fragmentos con una longitud de 300-800 pb mediante el método de pulverización y agrega diferentes adaptadores a ambos extremos de los fragmentos, o realiza una amplificación por PCR después de desnaturalizar el ADN a analizar y conecta el vector. para construir una biblioteca de ADN monocatenario (Figura 5a).

(2) Reacción en cadena de la polimerasa en emulsión (la reacción en cadena de la polimerasa en emulsión es en realidad un proceso único de inyección de agua en aceite)

Por supuesto, el proceso de amplificación de ADN es diferente al de Illumina. una gran diferencia. Combina este ADN monocatenario con perlas magnéticas recubiertas de agua y aceite de aproximadamente 28 µm de diámetro, las incuba y las hibrida.

La característica más importante de la PCR en emulsión es que puede formar una gran cantidad de espacios de reacción independientes para la amplificación del ADN. La tecnología clave es la "inyección de agua en petróleo" (petróleo en agua). El proceso básico consiste en inyectar una solución acuosa que contiene todos los componentes de la reacción de PCR en la superficie del aceite mineral que gira a alta velocidad antes de la reacción de PCR. La solución acuosa forma instantáneamente innumerables pequeñas gotas de agua envueltas en aceite mineral. Estas gotas de agua forman un espacio de reacción de PCR independiente. Lo ideal es que cada gota contenga sólo una plantilla de ADN y una perla magnética.

La superficie de estas perlas recubiertas de agua contiene secuencias de ADN que son complementarias a los conectores, por lo que estas secuencias de ADN monocatenario pueden unirse específicamente a las perlas. Al mismo tiempo, el sistema de incubación contiene reactivos de PCR, lo que garantiza que cada pequeño fragmento unido a las perlas magnéticas pueda amplificarse de forma independiente mediante PCR y que el producto amplificado aún pueda unirse a las perlas magnéticas. Cuando se completa la reacción, se puede destruir el sistema de incubación y enriquecer las perlas magnéticas que contienen ADN. Después de la amplificación, cada pequeño fragmento se amplificará aproximadamente 654,38+0 millones de veces para alcanzar la cantidad de ADN necesaria para la siguiente secuenciación.

(3) Pirosecuenciación

Antes de la secuenciación, las perlas magnéticas con ADN deben tratarse con polimerasa y proteína de unión monocatenaria, y luego las perlas magnéticas se colocan en la placa PTP. . Este tipo de placa está especialmente equipada con muchos orificios pequeños con un diámetro de aproximadamente 44 um, y cada orificio pequeño solo puede acomodar una cuenta magnética. De esta manera, la posición de cada perla magnética se fija para la detección de la siguiente reacción de secuenciación.

El método de secuenciación utiliza pirosecuenciación. Se colocan perlas magnéticas con un diámetro más pequeño que los orificios de la placa de PTP en los orificios para iniciar la reacción de secuenciación.

La reacción de secuenciación utiliza una gran cantidad de ADN monocatenario amplificado en perlas magnéticas como plantilla, y se agregan dNTP a cada reacción para su síntesis. Si el dNTP se puede emparejar con la secuencia que se va a probar, el grupo pirofosfato se liberará después de la síntesis. El grupo pirofosfato liberado reaccionará con la enzima química sulfato de ATP en el sistema de reacción para generar ATP. El ATP y la luciferasa generados se oxidan juntos, lo que hace que las moléculas de luciferina en la reacción de secuenciación emitan fluorescencia, que es registrada por la cámara CCD en el otro lado de la placa PTP. Finalmente, el resultado final de la secuenciación se obtiene mediante el procesamiento de la señal de luz por computadora. . Dado que cada dNTP produce diferentes colores de fluorescencia durante la reacción, la secuencia de la molécula detectada se puede determinar en función del color de fluorescencia. Después de la reacción, los dNTP libres degradarán el ATP bajo la acción de la bisfosfatasa, lo que provocará una extinción de la fluorescencia, lo que permitirá que la reacción de secuenciación entre en el siguiente ciclo. En la tecnología de secuenciación 454, cada reacción de secuenciación se realiza en un pocillo independiente en la placa PTP, lo que reduce en gran medida la interferencia mutua y el sesgo de secuenciación. La mayor ventaja de la tecnología 454 es que puede lograr una longitud de lectura prolongada. Actualmente, la longitud de lectura promedio de la tecnología 454 puede alcanzar los 400 pb, lo que es diferente de las tecnologías Solexa e Hiseq de Illumina. Su principal desventaja es que no puede medir con precisión la longitud de los homopolímeros. Por ejemplo, cuando hay algo como PolyA en la secuencia, se agregarán múltiples T a la vez en la reacción de secuenciación, y el número de T agregados solo se puede estimar mediante la intensidad de la fluorescencia, lo que puede generar resultados inexactos. También es por esta razón que la tecnología 454 introducirá errores de secuenciación de inserción y eliminación durante el proceso de secuenciación.

Tecnología de estado sólido

La tecnología de secuenciación de estado sólido es un instrumento que ABI comenzó a implementar en aplicaciones comerciales de secuenciación en 2007. Se basa en el método de la ligasa, que utiliza ADN ligasa durante el proceso de ligación para la secuenciación (Figura 6)2,4. El principio es:

(1) Construcción de la biblioteca de ADN

Interrumpa el fragmento, agregue adaptadores de secuenciación a ambos extremos del fragmento, conecte el vector y construya un ADN monocatenario. biblioteca.

(2) PCR en emulsión

El proceso de PCR sólido es similar al del 454, usando el mismo método, pero estas perlas son mucho más pequeñas que las del sistema 454, solo 1um . Al mismo tiempo, se modifica el extremo 3' del producto amplificado para prepararlo para el siguiente proceso de secuenciación. Las microesferas modificadas de 3' se depositarán sobre el portaobjetos de vidrio. Durante la carga de microesferas, la cámara de deposición divide cada portaobjetos en 1, 4 u 8 regiones de secuenciación (Figura 6-a). La mayor ventaja del sistema de estado sólido es que cada portaobjetos puede acomodar una mayor densidad de perlas que el 454, lo que facilita lograr un mayor rendimiento en el mismo sistema.

(3) Secuenciación de ligasa

Este paso es único en la secuenciación de estado sólido. No utiliza la ADN polimerasa habitualmente utilizada en secuenciaciones anteriores, sino que utiliza una ligasa. El sustrato de la reacción de ligadura en fase sólida es una mezcla de sonda fluorescente monocatenaria de 8 bases, que se representa simplemente como 3'-XXnnnzzz-5'. En la reacción de ligación, estas sondas se emparejan con la cadena molde de ADN monocatenario según reglas de complementariedad de bases. El extremo 5' de la sonda está marcado con cuatro tintes fluorescentes, a saber, CY5, Texas Red, CY3 y 6-FAM (Figura 6-a). En esta sonda fluorescente monocatenaria de 8 bases, se determinaron las bases en la primera y segunda bases (XX), y se agregaron diferentes marcadores fluorescentes en las posiciones 6-8 (zzz) según las diferentes especies. Este es un método único de secuenciación de estado sólido. Dos bases determinan una señal de fluorescencia, lo que equivale a determinar dos bases al mismo tiempo. Este método de secuenciación también se denomina secuenciación de dos bases. Cuando la sonda fluorescente puede conectarse a la cadena plantilla de ADN, emite una señal fluorescente que representa las bases 1 y 2. Las guías de colores en la Figura 6-a y la Figura 6-b muestran la relación entre diferentes combinaciones de 1,2 bases y color fluorescente. Después de registrar la señal fluorescente, corte químicamente entre las bases 5 y 6 para eliminar la señal fluorescente para la secuenciación en la siguiente posición. Pero vale la pena señalar que a través de este método de clasificación, la posición de cada clasificación difiere en 5 bits. es decir, 1 y 2 la primera vez, 6 y 7 la segunda vez... Después de medir los extremos, la hebra recién sintetizada debe desnaturalizarse y eluirse. A continuación, se utilizó el cebador n-1 para la segunda secuenciación. La diferencia entre el cebador n-1 y el cebador N es que hay una diferencia de base en la posición donde se emparejan con el adaptador (Figura 6-a.8).

Es decir, el cebador n-1 mueve la posición de secuenciación al extremo 3' según el cebador N, de modo que se pueden determinar las posiciones 0, 1, 5 y 6... se completa la segunda ronda de secuenciación, y así En adelante, hasta la quinta ronda de secuenciación, finalmente se puede completar la secuenciación de bases de todas las posiciones y las bases de cada posición se detectan dos veces. La longitud de lectura de esta tecnología es de 2 × 50 pb y el ensamblaje de secuencia posterior también es relativamente complejo. Debido a la detección dual, la precisión de secuenciación original de esta tecnología llega al 99,94% y la precisión de cobertura 15x es del 99,999%, lo que debería decirse que es la tasa de precisión más alta entre las tecnologías de secuenciación de segunda generación actuales. Sin embargo, en la etapa de decodificación de fluorescencia, dado que la señal de fluorescencia está determinada por dos bases, una vez que ocurre un error, es probable que ocurran errores de decodificación de cadena.

Tecnología de secuenciación de tercera generación

La tecnología de secuenciación ha alcanzado un nuevo hito en los últimos dos o tres años. La tecnología SMRT y Oxford Nanopore de PacBio son tecnologías de secuenciación de molécula única de nanoporos, conocidas como tecnologías de secuenciación de tercera generación. En comparación con las dos generaciones anteriores, su característica más importante es la secuenciación de una sola molécula, que no requiere amplificación por PCR durante el proceso de secuenciación.

La tecnología PacBio SMRT en realidad aplica la idea de secuenciar mientras se sintetiza, utilizando chips SMRT como portadores de secuenciación. El principio básico es: la ADN polimerasa se une a la plantilla y marca cuatro bases (es decir, dNTP) con cuatro colores de fluorescencia. Durante la etapa de emparejamiento de bases, agregar diferentes bases emitirá una luz diferente y el tipo de base de entrada se puede determinar en función de la longitud de onda y el valor máximo de la luz. Al mismo tiempo, esta ADN polimerasa es una de las claves para conseguir longitudes de lectura ultralargas y está relacionada principalmente con el mantenimiento de la actividad enzimática, que se ve afectada principalmente por los daños causados ​​por el láser. Una de las claves de la tecnología PacBio SMRT es cómo distinguir la señal de reacción del fuerte fondo fluorescente de la base libre circundante. Utilizan el principio ZMW (agujero de guía de onda en modo cero): se pueden ver muchos agujeros densos en las paredes del horno microondas. El diámetro del agujero es muy delicado. Si el diámetro es mayor que la longitud de onda de las microondas, la energía penetrará en el panel y se escapará debido a la difracción, perturbando así los pequeños agujeros circundantes. Si la apertura es menor que la longitud de onda, la energía no se irradiará al entorno, sino que permanecerá en línea recta (el principio de difracción de la luz), proporcionando así protección. De manera similar, en un tubo de reacción (SMRTCell: pozo de reacción en tiempo real de una sola molécula), hay muchos nanoporos circulares, concretamente ZMW (agujeros de guía de onda de modo cero), con un diámetro exterior superior a 100 nanómetros y menor que la longitud de onda del láser de detección. (varios cientos de nanómetros). Después de que el láser golpea desde abajo, no puede penetrar los microporos y entrar en el área superior de la solución. La energía se limita a un rango pequeño (volumen 20x10) que cubre apenas la parte a detectar, de modo que la señal solo proviene de esta pequeña. área de reacción Demasiados agujeros Los monómeros de nucleótidos libres externos permanecen en la oscuridad, minimizando así el fondo. Además, la modificación de algunas bases se puede detectar detectando el tiempo de secuenciación entre dos bases adyacentes, es decir, si se modifica la base, la velocidad de paso a través de la polimerasa disminuirá y la distancia entre dos picos adyacentes aumentará. .grande, de modo que se pueda detectar información como la metilación entre ellos (Figura 7). La velocidad de secuenciación de la tecnología SMRT es muy rápida, aproximadamente 10 dNTP por segundo. Pero al mismo tiempo, su tasa de error de secuenciación es relativamente alta (esto es casi un problema común con la tecnología actual de secuenciación de una sola molécula), alcanzando el 15%. Sin embargo, afortunadamente, sus errores son aleatorios, a diferencia de la tecnología de secuenciación de segunda generación, que. tiene el sesgo de errores de secuenciación, por lo que se puede corregir eficazmente mediante secuenciación múltiple.

La tecnología de secuenciación de una sola molécula a nanoescala desarrollada por Oxford Nanopore Technologies se diferencia de las tecnologías de secuenciación anteriores en que se basa en señales eléctricas en lugar de señales ópticas. Un punto clave de esta tecnología es que diseñaron un nanoporo especial en el que se une covalentemente un conector molecular. A medida que las bases del ADN pasan a través del nanoporo, cambian su carga, lo que afecta temporalmente la fuerza de la corriente que fluye a través del nanoporo (cada base afecta el cambio de corriente en una magnitud diferente). La electrónica sensible detecta estos cambios para identificar el paso del ADN. las bases del nanoporo (Figura 8).

El año pasado, la empresa lanzó el primer secuenciador comercial de nanoporos en la reunión anual de Avances en Biotecnología Genómica (AGBT), atrayendo gran atención de la comunidad científica. La secuenciación de nanoporos (y otras tecnologías de secuenciación de tercera generación) tiene el potencial de abordar las deficiencias de las plataformas de secuenciación actuales. Las características principales de la secuenciación de nanoporos son: la longitud de lectura es muy larga, alrededor de decenas de kb, o incluso 100 kb, la tasa de error está actualmente entre el 1% y el 4%, y es un error aleatorio, en lugar de agruparse en ambos extremos; la lectura se puede leer en tiempo real; obtener datos; alto rendimiento (se espera que el genoma humano 30x se complete en un día) no se destruirá durante el proceso de secuenciación de la muestra;

En teoría, también es posible secuenciar el ARN directamente.

Otra característica importante de los cálculos de secuenciación nanoporosa de una sola molécula es que las citosinas metiladas se pueden leer directamente sin el tratamiento con bisulfito del genoma como en los métodos tradicionales. Esto será de gran ayuda para estudiar directamente los fenómenos relacionados con la epigenética a nivel del genoma. Además, la precisión de secuenciación del método mejorado puede alcanzar el 99,8%. Una vez que se descubren los errores de secuenciación, se pueden corregir fácilmente. Sin embargo, no parece haber informes relevantes sobre la aplicación de esta tecnología.

Otras tecnologías de secuenciación

Actualmente existe una nueva generación de tecnología de secuenciación revolucionaria basada en chips semiconductores: Ion Torrent 6. Esta tecnología utiliza un chip semiconductor de alta densidad cubierto con pequeños orificios, y un orificio pequeño es la celda de reacción de secuenciación. Cuando la ADN polimerasa polimeriza nucleótidos en la cadena de ADN extendida, libera un ion hidrógeno, que cambia el valor del pH en la célula. Los receptores de iones debajo de la célula detectan la señal del ion H+ y la convierten directamente en una señal digital para leer la secuencia de ADN. (Figura 9). ——El inventor de esta tecnología, Jonathan Rothberg, es también uno de los inventores de la tecnología de secuenciación 454. Su biblioteca y preparación de muestras son muy similares a la tecnología 454, e incluso se puede decir que es una copia de 454, excepto que durante el proceso de secuenciación, la información de la base de la secuencia se obtiene detectando cambios en las señales de H+ en lugar de detectar el color fluorescente del pirofosfato. . En comparación con otras tecnologías de secuenciación, el torrente de iones no requiere imágenes físicas costosas ni otros equipos, por lo que el costo es relativamente bajo, el volumen es relativamente pequeño, la operación es más simple y la velocidad es bastante rápida. Excluyendo los dos días de tiempo de preparación de la biblioteca, toda la secuenciación por computadora se puede completar en 2 a 3,5 horas. Sin embargo, el rendimiento de todo el chip no es alto, actualmente alrededor de 10G, pero es muy adecuado para secuenciar genomas y exones pequeños.

Resumen

Lo anterior explica brevemente los principios de cada generación de tecnología de secuenciación. La Tabla 1 y la Tabla 2 a continuación resumen las características de estas tres generaciones de tecnología de secuenciación. Entre ellos, el costo de secuenciación, la duración de la lectura y el rendimiento son tres indicadores importantes para evaluar la tecnología de secuenciación avanzada. Además de las diferencias en rendimiento y costo entre las tecnologías de secuenciación de primera y segunda generación, los principios básicos de la secuenciación (excepto Solid, que secuencia mientras se conecta) se basan todos en la idea de secuenciar mientras se sintetiza. La ventaja de la tecnología de secuenciación de segunda generación es que el costo se reduce considerablemente y el rendimiento mejora considerablemente en comparación con la primera generación. Sin embargo, la desventaja es que el proceso de PCR introducido aumentará la tasa de error de secuenciación hasta cierto punto. Sesgo sistemático y lectura corta. La tecnología de secuenciación de tercera generación se desarrolló para abordar las deficiencias de la segunda generación. Su característica básica es la secuenciación de una sola molécula, que no requiere ningún proceso de PCR. Esto es para evitar eficazmente errores sistemáticos causados ​​por el sesgo de PCR, al tiempo que se aumenta la longitud de lectura y se mantienen las ventajas de paso alto y bajo costo de la tecnología de segunda generación.

Tabla 1: Comparación de tecnologías de secuenciación

Tabla 2: Comparación de costos de secuenciación de secuenciadores convencionales

La Figura 10 a continuación muestra la distribución actual de secuenciadores globales. Los puntos calientes del gráfico se distribuyen principalmente en Shenzhen, China (principalmente BGI), Europa del Sur, Europa Occidental y Estados Unidos.

Referencia

Enlace original: http://www.huangshujiame/2013/08/02/2013-08-02-an-introduction-of-ngs-sequence. html