Documentos técnicos de influencia de MSK
MSK-IMPACT puede detectar ampliamente mutaciones de genes tumorales en el genoma mediante captura de panel, secuenciación NGS y análisis de letras de muestras FFPE de tejido tumoral y muestras normales. ¿Su plataforma de secuenciación es Illumina HiSeq? 2500 (calificado para MSK), los tipos de mutación detectados incluyen SNV, Indel (
El Apéndice 1a de la tabla adjunta enumera los puntos críticos de detección de MSK-IMPACT, y el apéndice 1b de la tabla adjunta enumera 468 genes y La información de transcripción correspondiente, apéndice 1c, enumera 73 genes e información de la región del exón. Debido a la baja profundidad de cobertura del Panel, no se informa que el control de calidad requiera que el contenido de células tumorales sea superior al 10 %. , el contenido del corte es superior al 20 % y el contenido de células tumorales de detección de MSI es superior al 25 %
Omitido
Utilice la consistencia del locus homocigótico para detectar el emparejamiento de muestras normales. y muestras de tumores de la misma muestra, se puede esperar que la discordancia del sitio homocigoto de la muestra emparejada sea baja (; 5%), está marcada como un tipo "posiblemente no emparejado".
Detecta la frecuencia. de diferentes alelos del sitio heterocigoto. Si la frecuencia es anormal, marque la muestra como tipo "posible contaminación".
Las muestras normales no deben contener SNV ni INDEL. El proceso de análisis detectará puntos críticos de mutación en muestras normales. si hay puntos calientes>; 1%, muestras etiquetadas
SNV (software MuTect) e INDEL (software SomaticIndelDetector) requieren muestras normales y emparejadas con tumores, si faltan muestras normales o el promedio. la profundidad de secuenciación de muestras normales es baja (
El análisis de muestras NC se utiliza para garantizar la ausencia de contaminación y el análisis de muestras PC se utiliza para garantizar la sensibilidad del análisis.
El control de calidad de las muestras tumorales requiere una cobertura de exón del 98% por encima de 200X, la profundidad normal de la muestra es superior a 50X.
Las mutaciones iniciales de SNV e Indel deben examinarse mediante la siguiente serie para garantizar la calidad. exactitud de las mutaciones informadas
(1)VF tumor/VF normal>=5, AD>=5, VF>=1%
(2) Si la mutación está en el. biblioteca de mutaciones de puntos de acceso, el Apéndice 1a es la lista de puntos de acceso.
(3) Puntos de acceso: DP>=20, AD>=8, VF>=2%; VF>=5%
(4) Filtre los resultados de la anotación para retener mutaciones no sinónimas y mutaciones de cambio de marco ubicadas en la región del exón.
El estado de todos los sitios MSI cubiertos por MSK. -IMPACT será calculado por la puntuación del software MSIsensor, si el umbral es superior a 10, se marcará como MSI-H.
El tejido o la sangre periférica del paciente se utiliza como muestra normal. Si se utilizan muestras normales no apareadas en lotes, puede haber algunas mutaciones raras de la línea germinal.
El control positivo es una mezcla de tres muestras positivas (cada muestra contiene información de mutaciones de diferentes tipos y frecuencias). , y la muestra normal del control positivo es una mezcla de muestras normales del mismo lote. Después del análisis del proceso, se prueban los resultados del análisis. (1) ¿Se detectan mutaciones conocidas? (2) ¿La frecuencia de mutación detectada es consistente con la muestra original? La Tabla 2 es una muestra con frecuencias de mutación conocidas.
La muestra de control negativo es una mezcla de muestras normales FFPE sin contaminación tumoral ni mutaciones en el número de copias de la línea germinal que han sido confirmadas mediante experimentos repetidos previos. Análisis anteriores han identificado polimorfismos y frecuencias específicos en muestras normales, y las frecuencias de mutación de los 862 SNP producidos por este proceso se compararon con las frecuencias de mutación esperadas para calcular la concordancia de Pearson. La frecuencia de mutación esperada debe ser superior a 0,9
Sin control de plantilla (NTC)
Índice de control de calidad de la muestra:
El concepto de análisis de potencia se utiliza aquí para Calcule la profundidad de cobertura requerida.
Determinación de la profundidad de cobertura del exón 1a:
Cuando la línea de detección mínima potencial se establece en 2 %, el nivel significativo de profundidad de lectura se puede calcular mediante análisis de potencia. Por ejemplo, cuando la frecuencia de mutación es del 10%, con un intervalo de confianza del 95% de profundidad 500X, la frecuencia de mutación oscila entre el 7,5% y el 13%.
Por lo tanto, al mezclar 10 muestras normales FFPE no relacionadas en moles iguales, se generaron una serie de frecuencias de mutación preestablecidas, siendo la frecuencia de mutación más baja del 5%. Luego se utilizaron 862 SNP para verificar la relación entre la frecuencia de mutación preestablecida y la frecuencia de mutación real. Finalmente, los datos experimentales apoyan el uso del 5% como límite inferior para las mutaciones detectadas reportadas, con una frecuencia potencial real del 10%.
Configure réplicas durante y entre ejecuciones, con 5 réplicas por muestra.
1a verificación de la precisión del panel (verificación estándar)
10 muestras (9 muestras FFPE y una línea celular comercial) representan diferentes tipos de tumores y diferentes tipos de mutaciones (se conocen tipos de mutaciones) y diferentes frecuencias de mutación (frecuencias de mutación conocidas).
2b Validación de la coherencia de la precisión del panel y la reproducibilidad (validación estándar)
Al evaluar la precisión de las mutaciones conocidas, la Tabla 6 también valida que, excepto las detectadas en muestras duplicadas, la reproducibilidad de mutaciones distintas de mutaciones conocidas.
Consistencia de todas las mutaciones detectadas en cinco muestras replicadas
Consistencia de las frecuencias de mutación detectadas en cinco muestras
Tabla 7 Resultados de verificación de precisión para 10 muestras de prueba (cada muestra repetido 5 veces) se enumeran.
LoD es la frecuencia alélica de una mutación que se puede detectar de forma estable en el 95% de las réplicas. Esta parte es el LoD para verificar la mutación hipotética. La prueba se divide en dos partes. La primera parte es la dilución en serie para determinar la frecuencia de mutación mínima confiable; la segunda parte es verificar el LoD en múltiples réplicas;
Dilución de gradiente 1a
Seleccione 10 muestras FFPE y seleccione los 5 exones con mayor cobertura y los 5 exones con menor cobertura. Prepare 5-8 diluciones de gradiente.
Tabla de resultados de la prueba 10
Comparación de los métodos de mutación 1a SNV/indel
Comparación de los resultados originales del método de choque MSK y el método de choque MSK después de la verificación ortogonal. * * *Se detectaron 48 exones de 20 genes en 433 muestras FFPE y se detectó un total de 267 sitios de mutación únicos. Se detectaron mutaciones conocidas * * * en 432 de las 433 muestras y en una muestra se omitió una inserción del gen EGFR.
Consulte la tabla de conformidad 15A-C-C.
Hay dos tipos de mutaciones reportadas por MSK: una es una mutación cancerosa con importancia clínica y la otra es una mutación cancerosa con importancia potencial.
Validación de muestras clínicas 1a
MSK analizó a más de 10 000 pacientes con cáncer avanzado y almacenó registros médicos e información sobre mutaciones en el siguiente sitio web.
https://www.cbioportal.org/study/summary?id=MSK_impact_2017
https://www.accessdata.FDA.gov/cdrh_docs/reviews/d EN170058 .pdf