Información básica sobre microesferas inmunomagnéticas
Las microesferas inmunomagnéticas se utilizan principalmente para la separación celular, etc. Dado que puede unirse específicamente a la sustancia objetivo y hacer que produzca una respuesta magnética, las microesferas inmunomagnéticas se cultivan conjuntamente con una mezcla compleja que contiene la sustancia objetivo (sustancia a separar). Luego, las microesferas inmunes pueden unirse selectivamente a la sustancia objetivo mediante una reacción antígeno-anticuerpo. Cuando el complejo pasa a través del dispositivo de campo magnético, la sustancia objetivo unida a las microesferas inmunomagnéticas será retenida por el campo magnético y así separada de otros complejos.
Las microesferas inmunomagnéticas utilizadas para la separación celular tienen las siguientes condiciones: propiedades químicas estables y sin agregación; sin unión no específica a las células; fuerte unión entre las microesferas magnéticas y los anticuerpos, tamaño uniforme de las microesferas magnéticas y respuesta magnética Buena; , el contenido de nanomaterial magnético es uniforme; las microesferas magnéticas tienen un tamaño adecuado y las células no las engullen fácilmente.
Hay dos formas de combinar IMM con celdas, método directo y método indirecto. El método directo significa que el anticuerpo se une directamente a las microesferas magnéticas y luego se une a las células diana. El método indirecto se refiere a mezclar y cultivar células con anticuerpos específicos para unir los anticuerpos específicos a la superficie celular y luego agregar microesferas magnéticas pretratadas con IgG anti-ratón (anticuerpo secundario). Las microesferas magnéticas se unen indirectamente a las células diana. Los métodos directos pueden reducir los pasos de lavado e incubación, pero rara vez se utilizan anticuerpos monoclonales IgM. En comparación con el método directo, el método indirecto no sólo tiene una amplia gama de usos, sino que también puede utilizar un grupo de anticuerpos monoclonales, por lo que obtendrá un mejor efecto de eliminación de células. Sin embargo, después de múltiples pasos de lavado, la especificidad disminuye.
El desarrollo de anticuerpos monoclonales contra monocitos ha permitido aislar células con marcadores de superficie específicos. Generalmente existen tres métodos diferentes, a saber, citometría de flujo (PACS), rosetas de glóbulos rojos alogénicos con anticuerpos secundarios adheridos a la superficie y técnicas de barrido con anticuerpos adsorbidos pasivamente en placas de cultivo de tejidos de poliestireno. Cada una de estas tecnologías tiene sus propias deficiencias. FACS es costoso, técnicamente complejo y, a menudo, se ve obstaculizado por la capacidad, viabilidad y esterilidad de las células seleccionadas. La técnica de la roseta de eritrocitos no puede manejar una gran cantidad de células. Además, no existen métodos establecidos y sencillos para conjugar anticuerpos con las membranas de los glóbulos rojos. La tecnología de panorámica también tiene muchas limitaciones. Es difícil de ampliar, los pasos son engorrosos y es imposible de cuantificar. Las células diana a menudo se mezclan con anticuerpos no específicos adsorbidos a otras células en el fondo de la placa de cultivo. En términos relativos, las microesferas inmunomagnéticas tienen las ventajas de un funcionamiento sencillo, una separación rápida y completa y una alta pureza celular, especialmente en términos de funcionamiento sencillo y ahorro de tiempo, son incomparables con otros métodos de separación.
Las perlas magnéticas son la clave para la clasificación de células. Tomemos como ejemplo las perlas magnéticas MACS patentadas de Miltenyi Biotec. El diámetro de las perlas magnéticas es de sólo 50 nanómetros, lo que equivale al tamaño de una partícula de virus y sólo una millonésima parte del tamaño de una célula eucariota. La microscopía electrónica de barrido sólo puede ver las perlas magnéticas en la superficie celular. Este tipo de perlas magnéticas pueden formar soluciones coloidales estables que no precipitan ni se agregan en un campo magnético. Las perlas magnéticas están compuestas de óxido de hierro y polisacáridos y se unen sólo hasta un tercio de los antígenos característicos de la superficie celular. Y debido a que el cuerpo es pequeño, las células pueden degradarlo y no activará ni afectará la función y vitalidad de las células, y las funciones fisiológicas de las células no cambiarán. Por lo tanto, no es necesario retirar las perlas magnéticas después del aislamiento celular, y las células aisladas positivamente (es decir, células marcadas magnéticamente) se pueden utilizar inmediatamente para análisis y experimentos posteriores.
La tecnología MACS puede aislar poblaciones celulares muy puras, con muy buenas tasas de recuperación y supervivencia. Dependiendo de la frecuencia celular y el nivel de expresión del marcador antigénico, la pureza de las células aisladas puede alcanzar el 95%-99,9% y la tasa de recuperación es >90%.
La tecnología MACS positiva de un solo paso puede seleccionar hasta 109 células. Independientemente de si el volumen de celda inicial es 105 o 1011, se utiliza el mismo procedimiento operativo simple. Se necesitan unos 15 minutos para etiquetar células magnéticamente y solo unos minutos para separar células magnéticas mediante una columna de clasificación. Se pueden utilizar columnas de diferentes tamaños para ordenar diferentes números de celdas a voluntad.
Las células marcadas magnéticamente se pueden teñir simultáneamente con tintes fluorescentes conjugados con anticuerpos, que se pueden utilizar para control de calidad y análisis de clasificación celular. Debido a que las perlas micromagnéticas de MAC son submicroscópicas, no afectarán la luz dispersa de las células marcadas. Las células clasificadas por MACS se pueden medir directamente con citometría de flujo y también son compatibles con microscopía de fluorescencia, PCR o FISH.
La tecnología MACS se puede utilizar para la clasificación positiva de células raras de tan solo 10-8. Para aquellas células que aparecen con menos frecuencia, se pueden combinar métodos de eliminación y métodos de selección positiva para su aislamiento. La separación celular ahora también se puede realizar basándose en las proteínas citoplasmáticas de las células o en las proteínas secretadas de las células activas.