¿Qué es la secuenciación de genes de próxima generación?
La idea central de la tecnología de secuenciación de segunda generación es la secuenciación por síntesis, que determina la secuencia del ADN mediante la captura de etiquetas finales recién sintetizadas. Las plataformas tecnológicas existentes incluyen principalmente Roche/454 FLX, el analizador de genoma Illumina/Solexa y el sistema de fase sólida de Applied Biosystems.
La característica principal de la tecnología de secuenciación de primera generación es que la longitud de lectura de secuenciación puede alcanzar los 1000 pb y la precisión puede alcanzar el 99,999%. Sin embargo, sus deficiencias, como el alto costo de secuenciación y el bajo rendimiento, afectan seriamente su aplicación real a gran escala. Por tanto, la tecnología de secuenciación de primera generación no es el mejor método de secuenciación.
Tras un continuo desarrollo y mejora tecnológica, nace la tecnología de secuenciación de segunda generación representada por la tecnología 454 de Roche, Solexa de Illumina, la tecnología Hiseq y la tecnología Solid de ABI.
La tecnología de secuenciación de segunda generación ha reducido considerablemente los costos de secuenciación, al mismo tiempo que ha aumentado considerablemente la velocidad de secuenciación y mantiene una alta precisión. Solía tomar tres años completar la secuenciación de un genoma humano, pero solo toma una semana usando la tecnología de secuenciación de segunda generación, pero la longitud de lectura de la secuencia es mucho más corta que la de la tecnología de secuenciación de primera generación.
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1) Construcción de bibliotecas de secuenciación.
Primero prepare el genoma (aunque la empresa de secuenciación requiere un volumen de muestra de 200 ng, el sistema analizador Gnome requiere un volumen de muestra tan bajo como 100 ng, que se puede utilizar en muchos experimentos con muestras limitadas), y luego Fragmentar aleatoriamente el ADN en pequeños fragmentos de varios cientos de bases o menos, con adaptadores especiales añadidos en ambos extremos. En el caso de la secuenciación del transcriptoma, la construcción de una biblioteca es relativamente problemática. Después de fragmentar el ARN, es necesario convertirlo de forma inversa en ADNc y luego agregar adaptadores, o primero es necesario convertir de manera inversa el ARN en ADNc y luego agregar los fragmentos a los adaptadores. El tamaño del fragmento (tamaño de inserción) tiene un impacto en el análisis de datos posterior y se puede seleccionar según sea necesario. Para la secuenciación del genoma, a menudo se eligen varios insertos de diferentes tamaños para obtener más información durante el proceso de ensamblaje.
2) Fijación de superficie y amplificación de puente.
La reacción de secuenciación de Solexa se realiza en un tubo de vidrio llamado celda de flujo. Este tubo de vidrio se subdivide en ocho carriles y la superficie interior de cada carril tiene innumerables cabezas monocatenarias fijas. El fragmento de ADN con el adaptador obtenido en el paso anterior se desnaturaliza en una sola hebra y luego se combina con el cebador adaptador en el canal de secuenciación para formar una estructura de puente para la preamplificación posterior.
3) Preamplificación (desnaturalización y amplificación completa)
Añadir dNTP sin marcar y enzima Taq ordinaria para realizar la amplificación por PCR del puente de fase sólida, y detectar el puente monocatenario Los fragmentos se amplifican en fragmentos de puente de doble cadena. Mediante la desnaturalización, las hebras individuales complementarias se liberan y se anclan a una superficie sólida cercana. Mediante circulación continua, se obtendrán millones de grupos de fragmentos bicatenarios a detectar sobre la superficie sólida de la celda de flujo.
4) Extensión y secuenciación de base única.
Agregue cuatro dNTP, ADN polimerasa y cebadores adaptadores marcados con fluorescencia a la celda de flujo de secuenciación para su amplificación. A medida que cada grupo de secuenciación extiende su cadena complementaria, cada dNTP marcado con fluorescencia puede liberar la fluorescencia correspondiente. El secuenciador captura la señal fluorescente y convierte la señal luminosa en un pico de secuenciación a través de un software de computadora para obtener la información de la secuencia del fragmento que se va a analizar. El proceso de obtener la información de la secuencia del fragmento que se va a detectar a partir de la señal de fluorescencia se denomina llamada de base y es el software utilizado por el software de control de secuencia del analizador de genoma y el software de análisis de tuberías de Illumina. La duración de la lectura puede verse afectada por muchos factores que provocan la atenuación de la señal, como la escisión incompleta de etiquetas fluorescentes. A medida que aumenta la duración de la lectura, también aumenta la tasa de error.
5) Análisis de datos
Estrictamente hablando, este paso no puede contarse como parte del proceso de operación de secuenciación, pero solo a través del trabajo preliminar de este paso es significativo. Los datos brutos obtenidos mediante la secuenciación son secuencias con una longitud de sólo unas pocas docenas de bases. Estas secuencias cortas deben ensamblarse en contigs o incluso estructuras de todo el genoma a través de herramientas bioinformáticas, o estas secuencias deben compararse con genomas existentes o secuencias de genomas de especies similares y analizarse más a fondo para obtener resultados biológicamente significativos.
Materiales de referencia:
Enciclopedia Baidu: tecnología de secuenciación de ADN de segunda generación