Tecnología de examen patológico

Sección congelada

Es el método de corte más utilizado en la tinción inmunohistoquímica. Su ventaja más destacada es que puede preservar relativamente bien la actividad inmune de múltiples antígenos, especialmente los antígenos de la superficie celular que deben ser secciones congeladas. Se pueden seccionar tanto tejidos frescos como fijos.

Al congelarse, el agua del tejido forma fácilmente cristales de hielo, lo que a menudo afecta la posición de los antígenos. Generalmente se cree que cuando hay pocos y grandes cristales de hielo, el impacto es pequeño; cuando hay muchos cristales de hielo pequeños y grandes, el daño a la estructura del tejido es mayor. El fenómeno anterior es más probable que ocurra en tejidos con mayor cantidad. contenido de agua. El tamaño de los cristales de hielo es directamente proporcional a su tasa de crecimiento e inversamente proporcional a la tasa de nucleación (tasa de formación). Es decir, cuantos más cristales de hielo se formen, más pequeños serán y más grave será el impacto en la estructura organizativa. será. Por lo tanto, la cantidad de cristales de hielo debe mantenerse lo más baja posible. Fish cree que cuando comienza la congelación, la velocidad de nucleación de los cristales de hielo es lenta y luego aumenta gradualmente, siendo su temperatura crítica -33ºC. C, desde -30. C cayó a -43. Entre C, la tasa de nucleación aumenta bruscamente hasta 1018 y luego se ralentiza. Según la teoría anterior, se pueden tomar las siguientes medidas para reducir la formación de cristales de hielo.

(1) La congelación rápida hace que la temperatura del tejido baje bruscamente, acortándola desde -33°C. C43. C tiempo para reducir la formación de cristales de hielo. Hay dos métodos:

① Método de hielo seco y acetona (alcohol): coloque 150-200 ml de acetona (alcohol) en un termo pequeño, agregue gradualmente hielo seco hasta que esté saturado y espeso, luego agregue hielo seco. hielo Cuando ya no esté en remojo, la temperatura puede alcanzar los -70 °C. Use un vaso pequeño (50-100 ml) para llenar aproximadamente 50 ml de isopentano y luego coloque lentamente el vaso en una solución saturada de acetona de hielo seco (alcohol puro). ) hasta que el isopentano se pueda utilizar cuando la temperatura alcance -70 ℃. Coloque el pañuelo (tamaño 1 cm × 0,8 cm × 0,5 cm) en isopentano para congelarlo rápidamente durante 30 a 60 segundos y luego sáquelo, o colóquelo en un congelador para cortarlo en rodajas, o guárdelo en un lugar a baja temperatura de -80 °C. refrigerador.

② Método de nitrógeno líquido: coloque el bloque de tejido plano en una tapa de botella de plástico suave o en una caja pequeña especial (de aproximadamente 2 cm de diámetro, si el bloque de tejido es pequeño, agregue una cantidad adecuada de agente de inclusión OCT). para sumergir el pañuelo y luego coloque el especial. Coloque lentamente la caja pequeña de manera plana en una taza pequeña llena de nitrógeno líquido. Cuando el fondo de la caja entre en contacto con el nitrógeno líquido, comenzará a vaporizarse y hervir. , la pequeña caja permanece en su lugar y no se sumerge en nitrógeno líquido. El tejido se evaporará rápidamente en unos 10 a 20 segundos. Retire los cubitos de hielo del tejido y colóquelos inmediatamente en un refrigerador de -80 ° C para almacenarlos hasta su uso posterior, o colóquelos en un microtomo congelador para seccionarlos congelados.

(2) Coloque el tejido en una solución de sacarosa al 20%-30% durante 1 a 3 días, utilizando hipertonicidad para absorber agua en el tejido y reducir el contenido de agua del tejido.

Son muchos los factores que afectan al seccionado de congelados, por lo que técnicamente resulta complicado elegir una buena máquina seccionadora de congelados es la clave para garantizar la calidad del corte. Actualmente existen dos tipos de criostato:

①Criostato: Es un criostato ideal con muchos modelos, pero su estructura básica es colocar el microtomo a -30°C Es en una habitación sellada de baja temperatura, por lo que no se ve afectado por la temperatura externa ni el ambiente al cortar. Puede cortar continuamente secciones delgadas de 2 a 4 μm, lo que puede cumplir completamente con los requisitos del etiquetado inmunohistoquímico. Al cortar, la temperatura adecuada en la habitación de baja temperatura es de -15 °C a 18 °C. Si la temperatura es demasiado baja, el tejido se romperá fácilmente. La posición y el ángulo de la placa antivuelco deben ser adecuados. El portaobjetos debe estar sujeto a la sección de tejido y no moverlo hacia arriba o hacia abajo.

②Criostato abierto: incluye criostato semiconductor y criostato de metanol, así como CO2, cloruro de etilo y otros criostatos antiguos. Está expuesto al aire al cortarlo, la temperatura es difícil de controlar y la tecnología de corte es difícil. En temporadas de altas temperaturas, el corte es aún más difícil y el grosor del corte es de 8 a 15 μm, lo que dificulta el corte. continuamente, sin embargo, su ventaja es que es barato y se produce en China.

Si los cortes congelados no se tiñen, se deben secar y conservar en frigorífico a baja temperatura, o prefijar brevemente y luego conservar en el frigorífico.

Cortes de parafina

Las ventajas La estructura del tejido está bien conservada y tiene un gran valor práctico en patología e investigación retrospectiva. Puede cortar secciones delgadas continuas, la estructura del tejido es clara y el posicionamiento del antígeno es preciso. La preparación de secciones de parafina para inmunohistoquímica es ligeramente diferente a la realización de películas convencionales: ① La deshidratación, la transparencia y otros procesos deben realizarse a 4°C. C para minimizar la pérdida de antígenos tisulares. ② El tamaño del bloque de tejido debe limitarse a 2 cm × 1,5 cm × 0,2 cm, para que el tejido esté completamente deshidratado, transparente e impregnado de cera. ③ Durante el proceso de inmersión e incrustación de cera, la parafina debe mantenerse por debajo de 60 °C, y lo mejor es la cera suave con un punto de fusión bajo (es decir, incrustación de parafina a baja temperatura).

Todo el proceso anterior tarda entre 18 y 24 horas y, en su lugar, también se puede utilizar un deshidratador automático a temperatura ambiente. Si el bloque de tejido es pequeño y el diámetro es inferior a 0,5 cm, se puede utilizar la inclusión y el corte en parafina rápidamente, y todo el proceso sólo dura unas 4 horas.

El corte en parafina es una tecnología de producción convencional. La mayoría de los micrótomos son de tipo rotativo. El espesor de la sección es de 2 a 7 μm. Tiene una amplia gama de aplicaciones, no afecta la penetración de los anticuerpos y la tinción es uniforme. . Dado que la fijación de formaldehído, los flujos orgánicos y los agentes de inclusión pueden causar ciertos daños y protección de los antígenos tisulares, las características del antígeno cambiarán. Algunas personas informan que la digestión con proteasas puede mejorar la intensidad de la tinción inmunohistoquímica bajo microscopía óptica. Los métodos de digestión más utilizados incluyen tripsina, pronasa y pepsina. Las secciones de parafina deben colocarse en una incubadora a 37°C durante la noche, de modo que hornear las secciones pueda reducir el fenómeno de desprendimiento durante el teñido. Si es necesario conservar las lonchas durante mucho tiempo, se pueden guardar en un frigorífico a 4°C para su uso posterior.

Las secciones de parafina tienen muchas ventajas, pero durante el proceso de producción, deben tratarse con disolventes orgánicos como alcohol y xileno, y algunas personas utilizan la liofilización. método de inclusión (método de inclusión de liofilización)), puede preservar sustancias solubles en los tejidos, prevenir la desnaturalización de proteínas y la inactivación de enzimas, reduciendo así la pérdida de antígenos. Este método consiste en congelar rápidamente tejido fresco a baja temperatura, usar un liofilizador para eliminar la humedad del tejido en condiciones de vacío y baja temperatura, luego fijar el tejido seco con vapor de formaldehído y finalmente sumergir el tejido en cera, incrustarlo y seccionarlo. Este método se puede utilizar para marcado por inmunofluorescencia, marcado por inmunoenzimas y autorradiografía.

Sección vibratoria

Utilizando un micrótomo vibratorio (Vibratotme), se puede cortar tejido fresco (no fijado ni congelado) en rodajas gruesas de 20 a 100 μm, y se puede realizar la inmunización. en la placa de reacción mediante el método flotante, tinción histoquímica, luego detectando las partes inmunorreactivas bajo un microscopio de disección, recortando el tejido para su posterior fijación y, finalmente, siguiendo la preparación de la muestra por microscopía electrónica, deshidratación, inclusión, corte ultrafino, observación de tinción, etc. El tejido no se congela y no se forman cristales de hielo ni se destruye el antígeno tisular. Evita el daño al antígeno por deshidratación, transparencia, incrustación y otros pasos del tejido antes de la tinción inmunohistoquímica. Puede retener mejor las sustancias liposolubles y la membrana celular. antígenos en el tejido Se utiliza principalmente para estudios que muestran la distribución de antígenos en el sistema nervioso. Este tipo de tinción previa a la inclusión es especialmente útil para la microscopía inmunoelectrónica.

Secciones de plástico

Los agentes de inclusión comúnmente utilizados para secciones incrustadas de plástico incluyen metacrilato (metacrilato de glicol, GMA) y resina epoxi (Epon 812, 618). , se puede realizar detección por microscopía óptica y microscopía electrónica para comparar los antígenos detectados entre sí y localizarlos con precisión. Las secciones incrustadas en plástico pueden cortar secciones más delgadas que las secciones de parafina, y las secciones de microscopio óptico pueden ser tan delgadas como de 0,5 a 2 um, por lo que se denominan secciones semifinas. GMA conserva bien los antígenos y no se agrega a los tejidos, pero su estructura morfológica es pobre. Las resinas epoxi como Fpon y Araldite pueden preservar mejor la estructura morfológica, pero interactúan fácilmente con los tejidos durante el proceso de polimerización y cambian la estructura del antígeno. Debido a los numerosos procedimientos de procesamiento de las secciones incluidas en plástico, la actividad del antígeno se pierde fácilmente. Al mismo tiempo, cuando se inmunotiñen secciones semifinas, el antisuero no puede penetrar fácilmente la resina. Por lo tanto, las secciones de plástico se utilizan principalmente para colocarlas antes de las ultramicrosecciones para microscopía inmunoelectrónica. Las muestras teñidas antes de su inclusión no necesitan teñirse después de realizar cortes finos. Las partes inmunorreactivas se observan directamente bajo un microscopio de contraste de fase para que aparezcan como puntos negros. Después del posicionamiento, se realizan cortes ultrafinos. de la microscopía inmunoelectrónica se puede mejorar significativamente.

Seccionamiento ultrafino

Consulte el Capítulo 7 para la preparación de muestras de microscopía electrónica. Para el corte se debe utilizar un microtomo ultrafino (Ultrotome).

Carbowax en rodajas

Carbowax, nombre científico es polietilenglicol (PEG), es una cera soluble en agua. Según sus diferentes pesos moleculares, existen muchos tipos de ceras de carbono, como 400, 800, 1000, 1500, 4000, 6000, etc. Hay dos tipos de ceras de carbono utilizadas para la inclusión de tejidos, 1500 y 4000, con puntos de fusión. de 38°C y 52°C respectivamente. C, es parafina sólida a temperatura ambiente y se funde hasta convertirse en líquido cuando se calienta.

La característica de este método es que después de fijar y lavar el tejido, se puede sumergir directamente en cera e incrustar sin deshidratación ni transparencia, y el método de corte es el mismo que el corte de parafina convencional. Los trozos de tejido cortados flotan en el agua y se despliegan de forma natural. El arco iris de carbono se profundiza rápidamente y los trozos de tejido se pueden aplanar. El proceso de producción es sencillo y sencillo.

La operación específica se describe brevemente de la siguiente manera: el bloque de tejido no debe ser demasiado grande, generalmente limitado a 1,5 cm × 1 cm × 0,1 cm. ①Después de fijar el pañuelo, lávelo bien con agua para quitar el fijador y use papel de filtro para absorber el agua de la superficie del pañuelo. ② Sumerja el tejido en cera de carbón (1500) a 45°C durante 30 minutos. ③Sumerja nuevamente en el líquido de cera de carbón mezclado (mezcla de 1500 y 4000 partes iguales), 52 ℃ durante 30 minutos. ④ Sumerja en cantidades iguales de líquido de cera de carbón mezclado (o ajuste la proporción de mezcla de 4000 y 5000 según los cambios de temperatura y humedad. Si la temperatura es alta y la humedad es alta, puede mezclar 4000:1500=3:2, de lo contrario, mezcle 2:3). ⑤ Utilice una cantidad igual de cera de carbón mezclada o ajuste la cera de carbón mezclada para incrustarla en un bloque de cera tisú. ⑥ El corte es lo mismo que el corte con parafina. Durante el funcionamiento, el bloque de tejido de cera de carbón debe mantenerse alejado del contacto con agua o hielo tanto como sea posible, y debe sellarse, secarse y refrigerarse durante el almacenamiento.

Las ventajas de este método son que se reducen los procedimientos operativos, se acorta el tiempo, el tejido no se daña con disolventes orgánicos, la temperatura es baja, la antigenicidad se conserva mejor que las secciones de parafina y la La estructura del tejido es clara. La desventaja es que el corte es más difícil cuando la temperatura ambiente es alta en verano y el corte continuo no es tan suave como el corte con parafina porque la cera de carbón es altamente higroscópica y no es fácil de almacenar durante mucho tiempo;