Los 10 problemas y soluciones más comunes en los experimentos de transferencia Western
1. Principio de la transferencia Western
El principio de la transferencia Western es que las proteínas se organizan de mayor a menor bajo la acción de un campo eléctrico, y la electroforesis se utiliza para la separación y el enriquecimiento. Las moléculas de proteínas con epítopos antigénicos son reconocidas específicamente por anticuerpos (anticuerpos primarios) y se unen a ellos. Sobre esta base, la enzima o el anticuerpo secundario marcado con fluorescencia reconoce y se une al anticuerpo primario, y la proteína objetivo se observa al reaccionar con el sustrato para desarrollar color.
Los métodos de desarrollo de color Westernblot incluyen principalmente los siguientes: (1) autorradiografía, (2) quimioluminiscencia del sustrato ECL, (3) fluorescencia del sustrato ECF, (4) desarrollo de color del sustrato DAB. Los sustratos utilizados actualmente incluyen quimioluminiscencia ECL y sustrato DAB para el desarrollo del color. La mayoría de los sustratos cromogénicos de Westernblot son sustratos quimioluminiscentes y los artículos publicados suelen utilizar el sustrato quimioluminiscente ECL
2. La señal de la proteína objetivo es débil o está ausente
En la detección de luminiscencia de Westernblot uno de los Los problemas más comunes son la señal débil o nula de la proteína objetivo. En primer lugar, considere si la membrana de transferencia es insuficiente/sobretransferida. Si es así, las condiciones de transferencia deben optimizarse. En segundo lugar, si la membrana de transferencia es adecuada, considere si la sensibilidad anticuerpo-antígeno es demasiado baja o puede ser el sustrato. HRP o actividad del sustrato La disminución se puede resolver aumentando el volumen de la muestra/aumentando la concentración de anticuerpos/usando sustratos sensibles/prolongando el tiempo de comprimido. Si el gel es demasiado espeso y el tiempo de exposición es corto, la señal de la proteína también se reducirá. Por lo tanto, se debe ampliar el tiempo de transferencia y el tiempo de exposición de la película.
3. Bandas no específicas
Las bandas no específicas están relacionadas con la reactividad cruzada de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales tienen mejor especificidad y mayor pureza que los anticuerpos policlonales. Además, es necesario diluir adecuadamente la concentración de anticuerpo primario/anticuerpo secundario. Si la muestra se degrada durante el procesamiento, agregue inhibidores de proteínas y opere en hielo durante el procesamiento de la muestra.
4. Después del revelado, la tira de la membrana se vuelve amarilla o blanca.
Puede ser que la sensibilidad o el fondo sean demasiado altos debido a una concentración demasiado alta de HRP y de anticuerpos. debe reducirse.
5. No hay puntos blancos revelados en las tiras
Generalmente, está relacionado con las operaciones de transferencia y revelado. Intente equilibrar la película antes de la transferencia, y preste atención a la. espacio entre el pegamento y la película. Evite las burbujas de aire. También se deben evitar las burbujas de aire entre la película y la película de rayos X durante el revelado.
6. La presencia de pequeñas manchas redondas dispersas
es causada por partículas de impureza en la solución bloqueadora de leche. Para resolver este problema, puede preparar la solución bloqueadora con anticipación y almacenarla. a 4 grados No lo mezcle al usarlo de manera uniforme, usando solo la capa superior.
7. ¿Cuál es el motivo de la extinción de la quimioluminiscencia de Western Blot (ECL)?
Las razones del "apagado" del Western Blot radican principalmente en dos aspectos: anticuerpos que contienen HRP y reactivos luminiscentes. Debido al uso prolongado de ciertos reactivos luminiscentes, las personas prestan más atención a los anticuerpos, pero no saben que los reactivos luminiscentes en realidad pueden tener un impacto significativo en los resultados experimentales. Para los anticuerpos, puede reducir adecuadamente la concentración del anticuerpo y realizar operaciones rápidas durante los experimentos de luminiscencia para resolver el problema de "apagado"; para los reactivos luminiscentes, puede elegir reactivos luminiscentes con luminiscencia estable para resolver el problema de "apagado".
8. El fondo de Western Blot es demasiado alto
El fondo profundo es el problema más común en la detección de luminiscencia de Western Blot y existen muchas razones para que se produzca un fondo profundo. En primer lugar, está la cuestión del bloqueo. Las condiciones de bloqueo son generalmente 5 leches o BAS a temperatura ambiente durante 2 a 4 horas, pero es mejor dejarlas durante la noche durante 4 horas. De hecho, la leche funciona bien para la mayoría de los anticuerpos, excepto los anticuerpos secundarios. Puede tener reacciones cruzadas con la leche, por lo que el lavado es importante. Además, BSA tiene una sola proteína, que puede reducir el fondo causado por otros componentes de la leche. En segundo lugar, la elución incompleta de TBST también puede provocar un fondo oscuro. El aumento adecuado del tiempo de elución, la frecuencia y la dosis puede reducir el color de fondo. A veces, la membrana no se infiltra completa y uniformemente, lo que también es una de las razones. En tercer lugar, la profundidad del fondo de la tira también está relacionada con el tiempo de exposición. Es normal que el fondo aparezca cuando el tiempo de exposición supera la media hora, por lo que se recomienda exponer durante 1 a 10 minutos si es posible. En cuarto lugar, una concentración de anticuerpos demasiado alta también puede provocar un fondo alto, por lo que se recomienda probarlo antes del experimento.
9. ¿Cuál es el papel del Tween-20 en el Western blot? ¿Cómo se debe utilizar?
Tween-20 es un tensioactivo no iónico. Se utiliza como emulsionante de aceite en agua, disolvente, agente difusor, estabilizador, lubricante y agente antiestático. La solución estacionaria para cromatografía de gases (temperatura máxima de funcionamiento 120 °C) separa y analiza aceites volátiles, ésteres de ácidos grasos, alcoholes, cetonas y haluros. La mayoría de los procedimientos de transferencia Western utilizan una solución de lavado TBST y también son pasos críticos, como el bloqueo y la incubación con anticuerpos primarios y secundarios. Por lo general, Tween-20 es un tensioactivo no iónico y su efecto es similar al del SDS y el BSA. Dado que la proteína unida a la membrana será reemplazada por algunos detergentes, se puede usar Tween20 para eliminar el detergente durante el bloqueo, y la concentración no debe exceder 0,3 (0,05 es la mejor si el efecto de bloqueo de la leche no es bueno, Tween). Se puede aumentar la concentración. El Tween en la solución de lavado WB es lo mismo que BSA, que brinda protección para las proteínas de antígenos y anticuerpos. Al mismo tiempo, debido a que es un surfactante (un compuesto después de agregar un grupo de óxido de etileno hidrófilo a Span), puede reducir la resistencia de los anticuerpos a El efecto no específico del antígeno se utiliza para eluir los anticuerpos no unidos y reducir la unión no específica. Tween-20: Cuando utilizamos TBST, la dosis de Tween-20 es de 0,5ml/L, sin añadir SDS.
10. Aparecen bandas deformadas.
Hay burbujas o impurezas en el gel, la corriente es inestable y el corte en frío del gel es desigual. Mantenga limpios el equipo de fabricación de gel y el tanque de electroforesis, reemplace el electrolito por otros nuevos para garantizar que los materiales estén libres de contaminación y elimine las burbujas de aire durante el proceso de fabricación del gel. Si el tanque de electroforesis es viejo, se recomienda reemplazarlo por uno nuevo. Intente elegir el orificio del medio para agregar muestra y evitar cargar muestras en ambos extremos.