Pasos experimentales de PCR detallados

1. Extracción de la muestra de ARN

1. Coger las células lisadas congeladas y colocarlas a temperatura ambiente durante 5 minutos para que se disuelvan por completo.

2. Separación en dos fases: Añadir 0,2 ml de reactivo TRIZOL por cada 1 ml de muestra lisada, y tapar bien el tubo. Después de agitar vigorosamente el tubo manualmente durante 15 segundos, incube de 15 a 30 °C durante 2 a 3 minutos. Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4°C. Después de la centrifugación, el líquido mezclado se dividirá en una fase inferior de fenol rojo, una capa intermedia y una fase acuosa superior incolora. Todo el ARN se divide en la fase acuosa. El volumen de la capa superior de la fase acuosa es aproximadamente el 60% del reactivo TRIZOL añadido durante la homogeneización.

3. Precipitación de ARN Transfiera la capa superior de la fase acuosa a un tubo de centrífuga limpio y libre de ARNasa. Agregue un volumen igual de alcohol isopropílico y mezcle para precipitar el ARN. Después de mezclar, incube de 15 a 30 °C durante 10 minutos y luego centrifugue a 12.000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. En este momento, el precipitado de ARN, que no era visible antes de la centrifugación, formará un sedimento gelatinoso en el fondo y las paredes laterales del tubo.

4. Limpieza de ARN: Retire el sobrenadante y agregue al menos 1 ml de etanol 75 (etanol 75 preparado con DEPCH2O) por cada 1 ml de muestra lisada con reactivo TRIZOL para limpiar el sedimento de ARN. Después de mezclar, centrifugar a 7 000 rpm durante 5 minutos a 4°C.

5. Secado de ARN Absorba con cuidado la mayor parte de la solución de etanol y deje que el sedimento de ARN se seque al aire a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.

6. Disolver el precipitado de ARN. Al disolver el ARN, primero agregue 40 μl de agua libre de RNasa y pipetee repetidamente con una pistola varias veces para disolverlo por completo. La solución de ARN obtenida se almacena a -80 °C. uso posterior.