Tendencias de desarrollo en diagnóstico veterinario in vitro: diagnóstico molecular
Los servicios médicos para mascotas, incluido el diagnóstico de enfermedades de las mascotas y los servicios de atención médica diaria, son el segundo subsector más grande en la industria de las mascotas después de los alimentos para mascotas. Dependiendo del tipo de enfermedad, los servicios médicos para mascotas incluyen enfermedades quirúrgicas de mascotas, enfermedades internas, enfermedades dermatológicas, enfermedades infecciosas e inmunizaciones para mascotas. Las enfermedades infecciosas son causadas por algunos microorganismos patógenos, como bacterias y virus, que pueden transmitirse entre algunos animales o entre varios animales. La clave para mantener bien a las mascotas es la prevención y el tratamiento de enfermedades, especialmente algunas infecciosas, que tienen un inicio agudo y se propagan rápidamente, lo que representa una gran amenaza para la salud de los animales.
A medida que la calidad de vida de las personas mejora gradualmente, los perros y gatos desempeñan un papel cada vez más importante en la vida de las personas. Y con la mejora año tras año de las actitudes de los propietarios y la calidad de la atención médica de las mascotas, la precisión del diagnóstico de enfermedades animales ha pasado gradualmente del anterior "hombre ciego y elefante" al nivel del diagnóstico molecular.
En la actualidad, la tecnología de diagnóstico molecular ha sido ampliamente utilizada en enfermedades infecciosas (incluyendo infecciones bacterianas, infecciones virales, parásitos, hongos, enfermedades humanas y animales, etc.). ), tumores y otros campos, debido a sus ventajas de alta sensibilidad, fuerte especificidad, simplicidad y rapidez, y detección cualitativa y cuantitativa. La contribución de los resultados de las pruebas de diagnóstico molecular a las decisiones médicas clínicas se ha mejorado aún más y la importancia de los resultados de las pruebas ha alcanzado un nivel sin precedentes.
En términos de tecnología de detección de enfermedades infecciosas en mascotas, los métodos de detección de ácido nucleico de diagnóstico molecular también tienen una alta sensibilidad y especificidad, lo que puede acortar en gran medida el período ventana para la detección de enfermedades infecciosas. Este método es también un método de oro para el diagnóstico clínico de enfermedades infecciosas humanas.
Entre ellos, la PCR es el método de diagnóstico molecular más utilizado. La tecnología de PCR utiliza un par de oligonucleótidos como cebadores para amplificar el ADN objetivo a través de un ciclo de desnaturalización-hibridación-extensión, que tiene las ventajas de una alta sensibilidad y una alta especificidad.
La PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real ha conseguido un salto cualitativo de la PCR cualitativa a la cuantitativa. La tecnología de PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real (agregar grupos fluorescentes al sistema de reacción de PCR y monitorear todo el proceso de PCR en tiempo real con la ayuda de señales de fluorescencia) no solo tiene las ventajas de la PCR tradicional, sino que también tiene una gran especificidad, alta sensibilidad, buena repetibilidad, velocidad de reacción rápida y cuantitativo. Es preciso y altamente automatizado y se ha convertido en un método estándar reconocido internacionalmente para la cuantificación de moléculas de ácido nucleico.
La PCR cuantitativa de fluorescencia en tiempo real puede diagnosticar con precisión las enfermedades de las mascotas de forma temprana.
En el trabajo clínico actual con mascotas, un problema común es que resulta difícil o imposible diagnosticar con precisión ciertos patógenos. El desempeño específico se encuentra en los siguientes aspectos:
1. La sensibilidad de la tecnología de diagnóstico existente es baja.
Por ejemplo: tiras reactivas de oro coloidal utilizadas habitualmente para el diagnóstico de virus. Aunque las tiras reactivas de oro coloidal pueden proporcionar un diagnóstico rápido, este método detecta patógenos a partir del nivel de proteínas y existe un cierto grado de reactividad cruzada e interferencia de los autoanticuerpos animales, lo que lleva a resultados falsos positivos y falsos negativos en aplicaciones clínicas;
2. Diagnóstico temprano de enfermedades (como el período de incubación) y enfermedades con altos requerimientos de antígenos.
Por ejemplo, el uso de técnicas de diagnóstico tradicionales (tiras reactivas de oro coloidal y métodos de detección ELISA) no pueden proporcionar una base de diagnóstico precisa. Como el moquillo canino y el parvovirus;
3. Hay muchos patógenos clínicos que no se han comercializado y no es conveniente producir reactivos comercialmente.
Actualmente, el diagnóstico de estos patógenos (como la peritonitis infecciosa felina) no se puede realizar en los hospitales donde los veterinarios trabajan clínicamente. Si se requieren frotis de sangre y exámenes de heces, será muy subjetivo y fácil pasar por alto el diagnóstico;
4.
Por ejemplo, la vacunación es la principal medida para prevenir enfermedades virales en perros y gatos, pero es difícil distinguir si los anticuerpos detectados por serología son producidos por inmunidad vacunal o por infección viral, mientras que la PCR puede detectar con precisión patógenos;
5. Todavía hay algunos casos en los que es difícil diagnosticar trazas de patógenos.
Enfermedades como Babesia parvum.
Por ello, la PCR (especialmente la PCR cuantitativa por fluorescencia en tiempo real) hace realidad el diagnóstico preciso de estas enfermedades.
De acuerdo con los requisitos del Plan Nacional de Vigilancia de Enfermedades Animales e Investigación Epidemiológica de 2013 emitido por el Ministerio de Agricultura, y en conjunto con los estándares nacionales vigentes de mi país para el diagnóstico de enfermedades de mascotas, la “Tecnología de Diagnóstico de Parvovirus Canino ”(GB/T27533-2011) y "Tecnología de diagnóstico del moquillo canino" (GB/T 27532-2065432).
La elección de los productos de PCR adecuados es especialmente importante para el diagnóstico por PET.
En el trabajo clínico, hay muchas PCR disponibles para que los veterinarios elijan, incluida la extracción sin ácidos nucleicos, la amplificación isotérmica, reactivos líquidos y reactivos liofilizados, PCR automática, etc., dejando a los veterinarios sin elección. A continuación se explicará en detalle cómo observarlos objetivamente y tomar decisiones científicas.
Si no se extrae el ácido nucleico, la probabilidad de falsos negativos aumentará.
La extracción de ácido nucleico es el "primer paso" en los experimentos de diagnóstico molecular y es un paso muy importante, porque el ácido nucleico de la muestra de PET debe extraerse primero antes de poder realizar pruebas posteriores, lo que demuestra la Importancia de la extracción de ácidos nucleicos.
La extracción de ácidos nucleicos tiene dos propósitos principales: purificación (para eliminar sustancias que interfieren en la muestra) y concentración (para aumentar la concentración de ácidos nucleicos en la muestra). Porque existen muchas interferencias e inhibidores en las muestras analizadas por PCR (suero, sangre total, solución de conservación de células, heces, etc.). ), el contenido de ácido nucleico es bajo, es difícil detectar directamente los ácidos nucleicos y la sensibilidad es pobre. Por lo tanto, antes de la detección, el ácido nucleico de la muestra debe lisarse, purificarse y concentrarse, es decir, extraerse. Este es el enfoque predominante en la industria.
Por ejemplo, el eluato de algunos hisopos nasofaríngeos e hisopos orales clínicos es muy simple, solución salina casi normal + una pequeña cantidad de secreciones + una gran cantidad de virus libre, que puede amplificarse directamente sin extracción de ácido nucleico. . El virus del herpes felino FHV-1 se puede analizar tomando muestras de la nariz y la boca con un hisopo de algodón. Si el eluato del hisopo está limpio, se puede omitir el paso de purificación, pero sin concentración, se reduce la sensibilidad de la prueba.
Además, las muestras complejas deben someterse a extracción de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el coronavirus felino (FCoV) se detecta principalmente en el líquido ascítico de los gatos. Las muestras de ascitis son muy viscosas y contienen grandes cantidades de proteínas, lo que las hace imposibles de detectar directamente. Esta muestra se amplifica directamente sin extracción. Esto no es un problema de sensibilidad reducida, sino un problema de no poder detectarla.
La desventaja de la amplificación isotérmica es su alto coste y muchos productos requieren protección por patente.
El instrumento de amplificación isotérmica es sencillo, el tiempo de detección es rápido y la sensibilidad de detección es similar a la de la PCR. La tecnología de amplificación isotérmica se inventó principalmente en el extranjero y aún se encuentra en el período de protección de patentes. Su aplicación no es popular y el costo es relativamente alto.
La tecnología de liofilización al vacío tiene muchas ventajas y es la tendencia de desarrollo de los reactivos de PCR.
Los componentes reactivos de la PCR incluyen agua purificada, cebadores, polimerasa, Mg2+, dNTP y sondas. Una vez mezclados estos ingredientes, se degradarán gradualmente y fallarán a temperatura ambiente. Por lo tanto, los reactivos de PCR líquidos deben dividirse en diferentes viales y almacenarse a -20 °C, y luego descongelarse y prepararse antes de su uso. Por tanto, el almacenamiento, transporte y manipulación de reactivos son engorrosos.
La tecnología de liofilización al vacío puede sublimar completamente la humedad del reactivo sin destruir los ingredientes activos. Los reactivos liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente, lo que elimina la necesidad de transporte por cadena de frío. Cuando se usa, se agrega agua para disolverlo y luego se puede usar como reactivos de PCR comunes, por lo que es una tendencia en los reactivos de PCR.
Aquí presentamos una nueva tecnología de amplificación de ácido nucleico: Suzhou Gendx (gendx.cn), así como una tecnología de amplificación isotérmica catalizada por enzimas (tecnología ERA) con derechos de propiedad intelectual completamente independientes. Mediante ingeniería genética se pueden desarrollar sistemas multienzimáticos como recombinasa, exonucleasa, polimerasa, etc. , se transformó y estableció un sistema de reacción de amplificación especializado. En condiciones de temperatura constante de 30 a 42 °C, se pueden amplificar fragmentos específicos de pequeñas cantidades de ADN/ARN en 20 minutos. Esta tecnología tiene la especificidad de la amplificación por PCR y la conveniencia de la tecnología LAMP, con alta precisión.
Tiene las ventajas de detectabilidad, sensibilidad, rapidez y especificidad. Los componentes de la reacción se mezclaron y liofilizaron hasta obtener un polvo seco, que es fácil de operar y de almacenar. Y todo el proceso es de producción propia, por lo que el precio relativo es más ventajoso. Al mismo tiempo, con su instrumento de amplificación de temperatura constante de fluorescencia, se puede realizar la detección in situ de ácidos nucleicos, sin restricciones de ubicación, tiempo y personal.
El diagnóstico molecular, como cuarta revolución en la tecnología de diagnóstico in vitro, utiliza métodos de biología molecular para detectar cambios en la estructura o nivel de expresión del material genético en pacientes (mascotas), para luego realizar un diagnóstico para prevenir y predecir enfermedades, diagnóstico, tratamiento y pronóstico para proporcionar información más precisa. Comparado con otros métodos de detección, tiene ventajas incomparables. Como método de detección más utilizado en el diagnóstico molecular, la PCR será cada vez más importante en el diagnóstico clínico de mascotas. Al mismo tiempo, también creemos que nuestra tecnología pionera de detección de ácido nucleico por amplificación isotérmica genética se destacará en el mercado de pruebas in situ oportunas por sus ventajas de velocidad de detección rápida y precio bajo.