Tecnología de análisis de fosforilación de proteínas de biología molecular
Actividad física, contracción muscular, metabolismo, aparición de tumores, etc. Según las estadísticas, más de un tercio de las proteínas de las células de los mamíferos pueden fosforilarse y la fosforilación reversible de las proteínas complica el estudio de las proteínas. Los principales aminoácidos fosforilados en las proteínas de las células eucariotas son serina, treonina y tirosina en una proporción de aproximadamente 1800:200:1121. La mayoría de las proteínas fosforiladas tienen múltiples sitios de fosforilación y sus sitios de fosforilación son variables. Por tanto, una proteína puede tener múltiples formas fosforiladas. Aunque el análisis proteómico de proteínas fosforiladas ha logrado grandes avances, todavía quedan muchas dificultades por resolver, incluido el enriquecimiento de proteínas fosforiladas y fragmentos de piel, la identificación de sitios de fosforilación reversibles y la cuantificación de sitios de fosforilación. 1. Identificación de proteínas fosforiladas
El contenido de proteínas fosforiladas en las células es muy pequeño. En el análisis de espectrometría de masas, las señales del segmento abdominal fosforilado a menudo son suprimidas por señales del segmento cortical no fosforilado. Por tanto, el enriquecimiento de proteínas fosforiladas y fragmentos de piel juega un papel muy importante a la hora de mejorar la detección de sitios de fosforilación.
Condensación de 1. 1 Proteínas fosforiladas
En el pasado, los métodos relacionados con el enriquecimiento de proteínas fosforiladas utilizaban principalmente la inmunoprecipitación con anticuerpos contra proteínas específicas. Pero primero es necesario entender la ley.
La clara de huevo no es adecuada para investigaciones a gran escala. Aunque recientemente han aparecido anticuerpos contra los grupos fosforilados, sólo lo son contra el fósforo.
Los anticuerpos contra la tirosina acidificada son más eficaces [41. Sin embargo, la especificidad del anticuerpo contra la serina y treonina fosforiladas no es fuerte. Recientemente comercializado
El kit de purificación y enriquecimiento de proteínas fosforiladas se ha utilizado con éxito en levaduras, pero no se ha reportado su aplicación en otros tejidos.
1.2 Tinción de gel de proteínas fosforiladas
El método clásico para detectar proteínas fosforiladas en mezclas de clara de huevo consiste en separar primero las proteínas mediante electroforesis y luego utilizar autorradiografía o Fósforo
Detección de proteínas acidificadas mediante inmunotransferencia. El pariente más cercano Q Diaround
La tinción en gel de proteína fosforilada es un importante avance tecnológico.
. Romper b]. Este tinte fluorescente especial se puede detectar directamente en el pegamento.
Para las proteínas que fosforilan serina, treonato y tirosina pero no fosforilan
se requieren anticuerpos especiales o marcadores isotópicos. Este tinte es adecuado para geles de poliacrilamida SDS y geles de poliacrilamida 2D.
Esta tinción es totalmente compatible con la posterior identificación por espectrometría de masas. SYPRO
La tinción de rubí es una tinción de proteína total. Pro-Q Diamond Dye y SYPRO Ruby Dye en cada correa de natación o en cada lugar.
Puedes comprender la proporción de proteína fosforilada respecto a la proteína total.
La combinación de dos tintes proteicos puede reducir el contenido de fósforo de las proteínas de alta abundancia.
El estado acidificado se diferencia del estado hiperfosforilado de las proteínas de baja abundancia.
Enriquecimiento de 2 fragmentos de piel fosforilados
La detección de los sitios de fosforilación muchas veces no se realiza directamente a partir del nivel de proteínas.
Probado, pero a nivel de piel. Pero debido a l.
Para la existencia del fenómeno se deben realizar segmentos de piel fosforilados antes del análisis.
Enriquecido.
2.1 Cromatografía de afinidad por metales inmovilizados
Actualmente el método más utilizado es el de aislar y enriquecer fragmentos abdominales fosforilados.
El método es la cromatografía de afinidad por metales fijos (fixed metal affinity)
Cromatografía, IMAC). En este método, la unión se realiza en forma de quelación.
Selección de iones metálicos (como Fe3., Fe., Tip, etc.) sobre el sustrato.
Se une selectivamente a los grupos fosfato de la superficie fosforilada a valores de pH elevados.
, o tampón fosfato. Elución
La solución desalada se puede utilizar directamente para análisis de espectrometría de masas.
IMAC suele ser rico en tirosina, serina y treonina fosforiladas.
Residuos de aminoácidos. Pero la limitación de este método es que perderá osos.
Retirar algo de piel fosforilada en baja abundancia que no se une a la columna IMAC.
Sección; La piel con múltiples sitios de fosforilación es muy atractiva debido a su fuerte afinidad
Algunos grupos ácidos (como el ácido aspártico y la glutamina) son difíciles de eluir; >Ácidos), donadores de electrones como la histidina) también se unirán a la columna.
Contaminación de piel no fosforilada. Por lo tanto, se utilizó el método IMAC para enriquecer ácido fosfórico.
La eficacia del peeling depende en gran medida de los iones metálicos elegidos.
Materiales de columnas empaquetadas y procedimientos de elución. Más recientemente, Ficaro
esperó que [C1] enfriara los residuos ácidos de la piel antes de proceder con el enriquecimiento IMAC.
Después del tratamiento, su especificidad mejora enormemente y se espera que se fosforile a gran escala.
Este análisis tiene amplias perspectivas.
2.2 Modificación química de segmentos abdominales fosforilados
Recientemente O da et al [1-1] colocaron piel o mezcla de proteínas en azufre alcalino.
En solución de dietanol, el P2 se utiliza para eliminar la serina o la fosforilación de la serina.
El grupo fosfato H3P0 se elimina de la treonina, y el doble enlace formado es susceptible a la influencia del azufre.
Reemplazo de dietanol, reemplazo de fosfato de Ryukyu. La biotina está vinculada a la piel o proteína marcada con Ryukyu a la que se inmoviliza la avidina.
Columna cromatográfica, conseguida gracias a la alta afinidad entre la biotina y la avidina.
Para conseguir el propósito de fosforilar la piel o enriquecer proteínas. La principal desventaja de este método es que no puede enriquecer las proteínas fosforiladas en tirosina ni la piel.
Zhou et al. I) Mediante otro método, se utilizó la fosforilación modificada con dióxido de carbono.
Reacción de concentración de imina: Añadir ácido bórico hemiférrico a la parte de ácido fosfórico para su modificación.
El injerto de piel y la resina de yodoftalamida se unen mediante enlaces de valencia y se liberan mediante decapado.
Ponlo. Este método se puede utilizar para enriquecer fosfotirosina y fosfotirosina.
Configurar serina fosforilada y treonina fosforilada, pero requiere muchos pasos.
Reacciones químicas y procesos de purificación en columna.