Lectura de literatura unicelular 001: Programa de inmunidad contra el cáncer mediada por células T de tipo innato y autorreactivo

Título del artículo: Programa de inmunidad autorreactiva contra el cáncer mediada por células T innatas

Fecha de publicación y revista: Publicado en Nature el 20 de abril de 2022

Factor de impacto: 2020/2021: 49.962

Contenido principal: Se descubrió un nuevo tipo de célula T asesina innata (célula T asesina innata, ILTCK) en el modelo de cáncer de mama en ratón (PyMT).

Características de este tipo de células:

1. Al igual que las células T CD8 tradicionales, expresan el receptor de células T (TCR), pero su activación no depende de las células dendríticas (Dendrític. Cell, DC), esta característica la acerca a las células linfoides innatas (Células linfoides innatas).

2. A diferencia de las células T CD8 tradicionales, ILTCK no expresa PD-1 ni otros receptores inmunosupresores, por lo que no entra en un estado de agotamiento celular, pero tiene una citotoxicidad (citotoxicidad) más potente contra las células tumorales. .

3. La mayoría de las células T tradicionales reconocen neoantígenos tumorales, mientras que ILTCK reconoce antígenos nativos tumorales y tiene una importante residencia tisular.

Resultados de la investigación:

1. Las ILTCK tienen un transcriptoma único

Para estudiar la heterogeneidad entre las células T infiltrantes de tumores, realizamos CD45+TCRβ+CD8α+ Las células en tejidos tumorales mamarios de ratón MMTV-PyMT (PyMT) se analizaron mediante secuenciación de ARN unicelular (scRNA-seq) y se obtuvieron cinco grupos diferentes. Los principales genes marcadores son los siguientes:

Al realizar más inferencias de trayectoria, observamos una gran cantidad de mezcla entre células iniciales/recientemente activadas (C1) y células agotadas (C2) (Figura 1d, e), lo que refleja Cambios fenotípicos impulsados ​​por estimulación crónica. Por el contrario, las células αβILTCK (C3) y en proliferación (C5) se separaron aún más de C1 (Fig. 1d, e). Después de corregir los "efectos del ciclo celular", la trayectoria hipotética de la transición de ILTCK recientemente activada a αβ se mantuvo distinta de la vía de diferenciación de células T recientemente activada a agotada (Datos ampliados, Fig. 2a, b). Por lo tanto, las células C1 dan lugar a células C3 a través de una vía de diferenciación única o no son sus progenitoras. La firma de grupos de células T CD8α tipo c3 infiltrantes de tumores con alta expresión del gen αβILTCK se replicó en tumores mamarios PyMT y modelos de cáncer de próstata en ratones (Datos ampliados, Fig. 2c-h), así como en cáncer colorrectal humano 4 ( Datos ampliados Fig. 2i – k) La existencia, *** sugiere simultáneamente que el programa de diferenciación αβILTCK representa una respuesta inmune inducida por tumores conservada evolutivamente.

2. ILTCKtcr puede reconocer antígenos tumorales no mutados

Para explorar la relación entre las células NK1.1+CD8α+αβILTCK residentes en tumores y las células T PD-1+CD8α+ tradicionales ( Células T PD -1+), obtuvimos un mapa de las secuencias de TCR emparejadas utilizadas por cada subconjunto (Datos ampliados, Fig. 3a, Tabla complementaria 1). Sin embargo, las longitudes de la región determinante de la complementariedad 3 (CDR3) fueron similares entre los TCR de NK1.1 + αβILTCK y células T PD-1 + (Datos ampliados, figura 3b). En particular, no detectamos ningún par de TCR utilizado por las células T NK1.1+αβILTCK y PD-1+, lo que sugiere que no se desarrollaron a partir de un progenitor distinto.

Para determinar la especificidad de los TCR de cada subpoblación, analizamos su respuesta a las células cancerosas PyMT primarias utilizando un sistema de ensayo indicador de TCR mejorado (Fig. 2b, Datos ampliados, Fig. 3c, Tabla complementaria 2). 26 de 33 TCR derivados de NK1.1+αβILTCK (78,8%) mostraron una reactividad significativa contra células cancerosas heterólogas (Figura 2c, tabla de instrucciones, que muestra que reconocen células cancerosas de múltiples ratones* **Antígeno no mutado compartido).

Por el contrario, ninguno de los TCR derivados de células T PD-1+ respondió por encima de los niveles de fondo establecidos por OT-ITCR irrelevantes (Fig. 2c), lo que implica que respondieron a neoantígenos específicos de tumores individuales.

Cuando las células cancerosas carecen de los genes codificantes del clásico complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) (H2-K1 y H2-D1) o de la subunidad obligada B2m de todas las moléculas del MHC-I, esta capacidad de respuesta se pierde. . Esto sugiere que αβILTCKtcr, al igual que sus homólogos de células T CD8+, están restringidos principalmente al MHC-I clásico.

Para probar si αβILTCKTCR reconoce las moléculas de MHC-I independientemente de la secuencia peptídica, utilizamos líneas celulares cancerosas derivadas de tumores PyMT que carecen del transportador peptídico del retículo endoplásmico TAP1 y, por lo tanto, tienen moléculas de MHC-I de superficie prácticamente indetectables. nivel (Datos ampliados Fig. 4f). La expresión de MHC-I estabilizada con péptido Siinfekl no fue suficiente para activar los TCR αβILTCK (Datos ampliados, figura 4g, h), lo que indica que estos TCR reconocen complejos péptido-MHC-I específicos en lugar de la propia molécula de MHC-I.

3. Las ILTCK se seleccionan de forma agonística

Para estudiar si las células T CD8+ tradicionales producen NK1.1+αβILTCK, reorganizamos las ILTCK endógenas en células T CD8+. Se reemplazó el TCR con un TCR derivado de αβILTCK (Datos ampliados, figuras 5a-e). Después de la transferencia adoptiva a ratones receptores con tumores (Fig. 2d), las células T CD8 + que expresan TCR derivado de αβILTCK mostraron una regulación positiva de la expresión de PD-1 pero no de la expresión de NK1.1 (Fig. 2e, f, Datos ampliados, Figura 5f). Además, las respuestas de células T CD8 + convencionales requirieron células dendríticas tipo 1 convencionales (cDC1) dependientes de BATF3 e irf8 para iniciarse, mientras que las respuestas intratumorales de NK1.1 + αβILTCK fueron independientes de las cDC1 (Datos ampliados, figura 6). Estos hallazgos sugieren que las αβILTCK son independientes del cebado mediado por células dendríticas en órganos linfoides secundarios y tienen una ontología distinta de la de las células T CD8+ convencionales. De hecho, en los tumores, los timocitos en desarrollo que expresan TCR derivados de αβILTCK produjeron de manera consistente y específica NK1.1+αβILTCK pero no células T PD-1+ (Fig. 2g-i, Datos ampliados Fig. 7a-c). Por lo tanto, las células T NK1.1+αβILTCK y PD-1+ representan dos opciones de destino celular mutuamente excluyentes que pueden ocurrir en cualquier linaje celular durante el desarrollo de timocitos de una manera dependiente de la especificidad de TCR.

Mientras que los timocitos con una biblioteca de TCR policlonal producen principalmente células T CD4 o CD8 positivas únicas (Fig. 3a, b), los timocitos que contienen αβILTCKTCR monoclonal solo producen células CD4-/loCD8-/lo (Fig. 3a,b, Datos ampliados Fig. 7d,e). Hasta ahora, todas las células T TCRαβ+ conocidas pasan por una etapa CD4+CD8+ doble positiva en el timo durante el desarrollo. Como se esperaba, las células T NK1.1+αβILTCK y PD-1+ residentes en el tumor, pero no las células B CD19+, fueron localizadas consistentemente por el alelo Rorc-cre, que está presente en los timocitos CD4+CD8+ de forma transitoria (Datos ampliados, Fig. 7f,g). Sin embargo, a diferencia de otras células T innatas, como las células T asesinas naturales invariantes (iNKT), que son impulsadas por el factor de transcripción Zbtb altamente expresado, las αβILTCK NK1.1+ no mapearon el destino del alelo Zbtb16-cre-Rosa26LSL-YFP (Extended Datos de la Figura 7h, i), posiblemente debido a la falta de timocitos CD4+CD8+ que expresan MHC-I clásico.

Tras la selección positiva, los timocitos CD4+CD8+ expresan transitoriamente niveles bajos de PD-1. Por el contrario, los timocitos que expresan αβILTCK-TCR mantuvieron una mayor expresión de PD-1 (Datos ampliados, Fig. 7j, k), lo que indica un historial de fuerte estimulación de TCR. De hecho, 23 de 33 TCR derivados de αβILTCK (69,7%) mostraron una reactividad sustancial contra el linaje de células epiteliales del timo en niveles superiores a los de OT-ITCR, lo que impulsó la selección positiva de células T CD8+ convencionales (Datos ampliados, Figura 7l, datos no mostrados). Estos hallazgos sugieren que una fuerte autorreactividad impulsa el compromiso del linaje αβILTCK, similar al proceso de selección de "agonistas" que especifica el destino de las células iNKT y los linfocitos intraepiteliales intestinales (IEL).

Para distinguir el papel del estroma hematopoyético y del estroma radiorresistente en la mediación de la selección de αβILTCK, utilizamos ratones de tipo salvaje o B2m-/- como receptores para generar células pequeñas de ratón con "transcripción inversa" de TCR. El compartimento progenitor tímico αβ ILTCK de los receptores B2m-/- no se modificó (Datos ampliados, Fig. 7m), pero solo se redujo ligeramente con la ablación de B2m y se redujo significativamente con la ablación de B2m en el compartimento hematopoyético (Datos ampliados, Fig. 7n). Por tanto, la señal de selección de agonistas para αβILTCK es proporcionada de forma redundante por compartimentos intersticiales hematopoyéticos radiosensibles y radiorresistentes.

4. Los ILTCK repoblan continuamente los tumores

Repueblan continuamente los tumores

Una gran cantidad de timocitos que portan αβILTCK-tcr*** expresan PD-1 y CD122 ( Datos ampliados, Figura 7j,k), un fenotipo que recuerda a los progenitores tímicos comprometidos con IEL. De hecho, los timocitos que expresan el tcr tumoral αβILTCK se diferenciaron en IEL intestinales además de los αβILTCK intratumorales, y ambas poblaciones expresaron homodímeros CD8αα (Datos ampliados, figuras 8a-c). Al transferirse adoptivamente a ratones portadores de tumores linfopénicos, los progenitores tímicos policlonales TCRβ + CD4- / loCD8- / loPD-1 + CD122 + produjeron tanto αβILTCK intratumorales como IEL intestinales (Fig. 3c, d, Datos ampliados, Figura 8d, e). Sin embargo, en ratones ricos en linfocitos, las células progenitoras αβILTCK e IEL se trasplantaron a tumores pero no al intestino delgado (Fig. 3c, d). Para explorar más a fondo la dinámica de la αβILTCK intratumoral y la regeneración de IEL intestinal, utilizamos el alelo Fgd5-creER-Rosa26LSL-tdTomato, en el que el tamoxifeno marcó con pulsos un subconjunto de células madre hematopoyéticas, lo que permitió un seguimiento estable de su progenie (Datos ampliados, Figura 8f). . En las células madre de médula ósea Lin?-KIT+SCA1+, con una eficacia de etiquetado del 20 %, aproximadamente el 3 % de los progenitores αβ ILTCK/IEL del timo estaban localizados en el destino, similar a las células CD4+CD8+, CD4 o CD8 positivas únicas y iNKT de ratón adulto. cámara (Datos ampliados, Figura 8g-i). Por el contrario, la capacidad de etiquetado de los CD8αα+IEL del intestino delgado fue insignificante (Datos ampliados, Fig. 8k,l), lo que confirma que la siembra temprana y la proliferación in situ son los principales medios para el mantenimiento de su población27. Por lo tanto, el compartimento intratumoral αβ ILTCK, pero no el compartimento IEL intestinal, se repone continuamente mediante células progenitoras tímicas.

5. La expresión de FCER1G marca el linaje ILTCK

Para comprender mejor las características del linaje ILTCK, comparamos NK1.1+αβILTCK infiltrantes de tumores y PD-1+T Se compararon las células con sus respectivas células progenitoras tímicas (Datos ampliados, Fig. 9a). Los genes regulados positivamente en los progenitores αβILTCK pero reprimidos en los progenitores maduros se enriquecieron en genes asociados con la estimulación antigénica, incluido el programa Tox-Pdcd1 (Datos ampliados, figura 9b, tabla complementaria 3), lo que refleja eventos de selección de agonistas. La regulación negativa de Lat y Cd2 en los progenitores de αβILTCK puede inhibir la señalización de TCR, lo que hace que los αβILTCK maduros sean menos susceptibles al agotamiento (Datos ampliados, figura 9c, tabla complementaria 3). En particular, los genes que codifican muchos receptores NK y moléculas de señalización estaban regulados positivamente en los progenitores de αβILTCK (Datos ampliados, figura 9d, tabla complementaria 3) y permanecieron altamente expresados ​​en NK1.1+αβILTCK maduros8. Por el contrario, las vías asociadas con la diferenciación de efectores terminales y los programas de residencia de tejidos, incluidos Gzmc, Itga1 e Itgae, probablemente se adquieran en respuesta a señales específicas del microambiente tumoral local (Datos ampliados, figura 9e, tabla complementaria 3).

Aunque la transferencia adoptiva de progenitores αβILTCK comprometidos continuó generando NK1.1+αβILTCK, una proporción significativa todavía eran células NK1.1? Es poco probable que esto sea el resultado de una heterogeneidad de TCR preexistente entre los progenitores de αβ ILTCK, ya que los timocitos que expresan TCR monoclonal también dieron lugar a subpoblaciones NK1.1 y NK1.1+ (Fig. 2g-i, Datos ampliados, Figura 7b, c). ). Las células NK1.1- fueron transcripcionalmente más similares a las NK1.1+αβILTCK que a las células T PD-1+ (Datos ampliados, figura 9f), pero expresaron una mayor expresión de transcripciones enriquecidas en progenitores tímicos de αβILTCK, incluido Pdcd1 (Tabla complementaria 4). . Los genes relacionados con la diferenciación de efectores terminales, incluido Gzmc, se regularon positivamente tras la adquisición de NK1.1 (Tabla complementaria 4). Por lo tanto, el etiquetado con NK1.1 activa las αβILTCK y puede no identificar todos los linajes de células αβILTCK en los tumores.

Los experimentos de scRNA-seq muestran que Fcer1g se expresa diferencialmente en el grupo αβILTCK (C3) definido transcripcionalmente en modelos de cáncer de ratón (Figura de datos ampliados.

1,9g,h) y etiquetó una subpoblación C3 que era transcripcionalmente similar a las αβILTCK de ratón en tejido tumoral de pacientes con cáncer colorrectal (Datos ampliados, Fig. 2i-k, 9i). Estas observaciones sugieren que Fcer1g puede definir el linaje αβILTCK conservado. marcador. De hecho, la proteína FCER1G se reguló positivamente en los progenitores αβILTCK tímicos PD-1hiCD122hi comprometidos, pero no en células CD8 positivas únicas, y continuó expresándose en células NK1.1+αβILTCK infiltrantes de tumores, pero no en células T PD-1+ (Datos ampliados). Fig. 9j, k), lo que indica que FCER1G marca de manera específica y estable células comprometidas con el linaje αβ ILTCK.

En los timocitos CD4?CD8α?TCRβ+CD1d?NK1.1?, la población FCER1G+CD122+ expresa niveles elevados de PD-1, carece de expresión de granzima B (GZMB) y tiene un fenotipo similar a ese. de CD122 y PD-1 *** se expresó en las mismas células progenitoras αβILTCK e IEL (Fig. 4a, b). Entre las células T que se infiltran en tumores, la población FCER1G + CD122 + siguió siendo CD4?, la mayoría de las cuales aumentaron los homodímeros CD8αα (Datos ampliados, Fig. 9l, m) y carecieron uniformemente de expresión de PD-1 (Fig. 4a, b). En particular, las células T FCER1G+CD122+ contenían tanto NK1.1+GZMB+/?αβILTCK como sus precursores inmaduros NK1.1?GZMB? (Fig. 4a, b). Por lo tanto, la expresión de FCER1G puede identificar completamente las αβILTCK infiltrantes de tumores independientemente de su estado de activación.

En pacientes con cáncer de colon, las células FCER1G+TCRβ+ también se detectaron fácilmente en tejidos tumorales (Figura de datos ampliados 9n), y su perfil de expresión del receptor *** fue similar al de los ratones (Figura de datos ampliados 9n,o). Las células T FCER1G+ se enriquecieron en tejido tumoral en relación con el colon normal adyacente (Fig. 4c, d), y expresaron niveles más altos de GZMB en comparación con PD-1+ (Fig. 4e). En conjunto, estos hallazgos identifican a FCER1G como un marcador que define el linaje αβILTCK y demuestran que el programa αβILTCK representa una respuesta inmune inducida por tumores conservada evolutivamente en ratones y humanos.

6.ILTCK puede diseñarse para el tratamiento del cáncer

De acuerdo con estudios previos que muestran que las NK1.1+αβILTCK dependen críticamente de la citoquina proinflamatoria IL-15, casi Se observó una pérdida completa de células progenitoras αβILTCK tímicas FCER1G + CD122 + en ratones Il15 (Fig. 5a, b). Debido a que la IL-15 se expresa tanto en tejidos linfoides como no linfoides, se desconoce la fuente exacta de IL-15 que impulsa la expansión y activación de αβ ILTCK dentro de los tumores. La ablación de Il15 en líneas celulares hematopoyéticas no afectó las respuestas de αβILTCK inducidas por tumores (datos no mostrados). En particular, la expresión de IL-15 aumentó significativamente en las células epiteliales mamarias transformadas en comparación con el tejido mamario sano (Figura 5c). IL-15 también fue fácilmente detectable en células epiteliales tumorales de pacientes con cáncer de colon (Datos ampliados, Fig. 10a), y la frecuencia de células T FCER1G+, pero no PD-1+, se correlacionó positivamente con los niveles de IL-15 (Fig. 5d). , Datos ampliados Figura 10a,b).

Para investigar si la IL-15 expresada por las células cancerosas modula las respuestas de αβILTCK, utilizamos ratones S100a8-cre-Il15fl/flPyMT, en los que Il15 se elimina en la transformación pero está ausente en el epitelio mamario sano. eliminaciones en (Datos ampliados, Figura 10c, datos no mostrados). Los niveles de células progenitoras tímicas FCER1G + CD122 + αβILTCK fueron similares en ratones S100a8-cre-Il15fl/flPyMT (Fig. 5e, f). En particular, en comparación con el grupo de control, las αβILTCK infiltrantes de tumores se redujeron significativamente en ratones S100a8-cre-Il15fl/flPyMT, mientras que la expresión de NK1.1 y GZMB en las αβILTCK residuales se redujo significativamente (Fig. 5e, f). En particular, los ratones S100a8-cre-Il15fl/flPyMT exhibieron un crecimiento tumoral acelerado en comparación con los controles de tipo salvaje (Fig. 5g). Estos hallazgos sugieren que los ILTCK pueden detectar la IL-15 derivada de células cancerosas para el seguimiento inmunológico del cáncer.

En particular, la IL-15 fue suficiente para inducir la regulación positiva de NK1.1 y GZMB y la regulación negativa concomitante de PD-1 en células progenitoras αβILTCK tímicas (Datos ampliados, Fig. 10d).

Para probar si la activación ectópica de la señalización de IL-15 en progenitores αβ ILTCK transferidos adoptivamente puede suprimir el desarrollo tumoral, purificamos progenitores αβ ILTCK tímicos de ratones Ubc-creER-Rosa26LSL-Stat5b-CA/+ tratados con tamoxifeno. Induce la expresión del factor de transcripción. STAT5B (STAT5B-CA), que coordina principalmente el programa transcripcional aguas abajo de la señalización de IL-15 31 (Datos ampliados, Figura 10e). Después de la transferencia adoptiva a ratones PyMT portadores de tumores con deficiencia de linfocitos, la expresión inducida de STAT5B-CA dio como resultado una expansión de 60 veces de las células transferidas y una regulación positiva uniforme de NK1.1 y GZMB en cuatro semanas (Datos ampliados, Fig. 10f-i). . Es importante destacar que los ratones que recibieron αβILTCK armados con STAT5B-ca mostraron una inhibición significativa del crecimiento tumoral en comparación con αβILTCK de control o ratones sin transferencia celular (Datos ampliados, figura 10j).

Cuando se transfirieron adoptivamente a huéspedes PyMT cargados de linfocitos, los progenitores de αβILTCK armados con STAT5B-ca colonizaron fácilmente los tejidos tumorales y experimentaron una sólida expansión y diferenciación efectora, lo que resultó en un crecimiento tumoral reducido (Fig. 5h-j, datos ampliados). figura 10k). Por el contrario, las células T CD8 positivas únicas armadas con STAT5B-ca transferidas adoptivamente no se injertaron ni se diferenciaron, probablemente debido a una menor frecuencia de clones reactivos al tumor y no se esperaba ningún cambio en el crecimiento del tumor (Fig. 5h-j). Por lo tanto, el eje de señalización de IL-15 en αβILTCK podría convertirse en un sustrato potente y explotable para desarrollar terapias contra el cáncer.

Discusión

En este estudio, establecimos el programa FCER1G+αβILTCK como una respuesta de células T inducida por tumores única y evolutivamente conservada e identificamos que la fuente de células cancerosas IL-15 es necesaria y suficiente impulsor de sus efectos antitumorales. Dado que FCER1G proporciona motivos de activación esenciales para múltiples receptores NK, su expresión temprana en células progenitoras αβ ILTCK tímicas puede mejorar su rápida adquisición de funciones efectoras sobre la regulación positiva del receptor NK en tejidos tumorales. Aunque FCER1G también marca específicamente un subconjunto de células similares a αβ ILTCK infiltrantes de tumores humanos, FCER1G32 puede inducirse mediante una exposición prolongada a IL-15 en un subconjunto de células T CD8+ humanas circulantes. Posiblemente, la expresión de FCER1G pueda estar regulada más dinámicamente en αβILTCK humanos que en αβILTCK de ratón. Además, FCER1G puede marcar otros linajes además del αβILTCK humano, y su resolución requiere más investigación. A pesar de la expresión generalizada de TCR reactivos a tumores, las αβ ILTCK8 activadas por IL-15 son prescindibles para la citotoxicidad.