¿Por qué el principio de la cromatografía en gel se basa en la masa molecular relativa de las proteínas en lugar del tamaño molecular? ¿Hay alguna diferencia?
Estudiada por primera vez por J.C. Moore en 1964, no solo se puede utilizar para la separación e identificación de sustancias de moléculas pequeñas, sino que también se puede utilizar para homólogos de polímeros con la misma sustancia química. propiedades pero diferentes volúmenes moleculares. (Separar los polímeros en una columna de separación según el volumen de la mecánica de fluidos moleculares)
1. Principios básicos
1.1 Principio de separación
Dejar que la solución de polímero se seque. paso a medir Para columnas cromatográficas con diferentes tamaños de poro, los caminos para que las moléculas pasen a través de la columna cromatográfica son los espacios entre las partículas (más grandes) y los poros pasantes de las partículas (más pequeños). Cuando la solución de polímero fluye a través de la columna cromatográfica, las moléculas más grandes quedan excluidas de los poros de las partículas y solo pueden pasar a través de los espacios entre las partículas a una velocidad más rápida; las moléculas más pequeñas pueden ingresar a las partículas a una velocidad mucho más lenta. Después de pasar por una columna cromatográfica de cierta longitud, las moléculas se separan según su peso molecular relativo. Aquellas con mayor peso molecular relativo están al frente (es decir, el tiempo de lavado es corto) y aquellas con menor peso molecular relativo. están en la parte trasera (es decir, el tiempo de descarga es mayor). El volumen total de eluyente recibido desde el momento en que la muestra ingresa a la columna hasta el momento en que se filtra se denomina volumen filtrado de la muestra. Cuando se determinan el instrumento y las condiciones experimentales, el volumen de lixiviación del soluto está relacionado con su peso molecular. Cuanto mayor es el peso molecular, menor es el volumen de lixiviación.
(1) Exclusión de volumen
(2) Difusión limitada
(3) Separación de flujo
1.2 Principio de corrección
Utilice un polímero estándar monodisperso de masa molecular relativa conocida para realizar previamente una curva de relación correspondiente entre el volumen de lavado o el tiempo de lavado y la masa molecular relativa, que se denomina "curva de calibración". Las muestras estándar monodispersas rara vez se encuentran en los polímeros y generalmente se reemplazan por muestras estrechamente distribuidas. En las mismas condiciones de prueba, prepare una serie de espectros estándar de GPC y trace el tiempo de retención de muestras con diferentes masas moleculares relativas usando lgM frente a T. La curva resultante es la "curva de calibración". A través de la curva de calibración, podemos calcular diversa información sobre la masa molecular relativa y la distribución de masa molecular relativa del espectro GPC. No hay muchos tipos de polímeros para los que se puedan preparar muestras estándar. Sin muestras estándar, es imposible tener una curva de calibración y es imposible obtener el peso molecular relativo y la distribución del peso molecular relativo del polímero utilizando el método GPC. Para ello se pueden utilizar principios de corrección universales.
1.3 Principio de Corrección Universal
Debido a que la separación de polímeros por GPC se basa en el volumen hidrodinámico molecular, es decir, para un mismo volumen hidrodinámico molecular, el fluido sale al mismo tiempo. tiempo de retención, es decir, el fluido El volumen mecánico es el mismo.
Los volúmenes hidrodinámicos de las dos cadenas flexibles son iguales:
[η]1M1=[η]2M2
k 1m 1α1+1 = k 1m 2α2+ 1
El logaritmo de ambos lados: lgk 1+(α1+1)lgm 1 = lgk 2+(α2+1)LG m2.
Es decir, si se conocen el valor K y el valor α de la muestra estándar y el polímero a probar, la masa molecular relativa M2 de la muestra a probar se puede calibrar con la muestra estándar. M1 de masa molecular relativa conocida.
[Editar este párrafo] 2. Parte experimental
Método directo: mientras se mide su concentración, se mide la viscosidad o dispersión de la luz del lixiviado para determinar su peso molecular.
Método indirecto: Utilizando un grupo de muestras monodispersas con diferentes pesos moleculares como muestras estándar, y midiendo sus volúmenes de disolución y pesos moleculares respectivamente, se puede determinar la relación entre ellos.
2.1.Instrumento:
El instrumento GPC consta de un sistema de bomba, un sistema de muestreo (automático), una columna de cromatografía en gel, un sistema de detección y un sistema de adquisición y procesamiento de datos.
2.1.1. Sistema de bombeo: incluye almacenamiento de disolvente, desgasificador y bomba de alta presión. Su función es hacer que la fase móvil (disolvente) fluya hacia la columna cromatográfica a un caudal constante. Las condiciones de funcionamiento de la bomba afectan directamente la precisión de los datos finales. Cuanto más preciso sea el instrumento, más estables serán las condiciones de funcionamiento de la bomba. El error en el caudal requerido debe ser inferior a 0,01 ml/min.
2.1.2. Columna cromatográfica: el componente central de la separación por GPC. Se añaden partículas con diferentes tamaños de poro como relleno en tubos huecos de acero inoxidable. Cada columna cromatográfica tiene un cierto rango de separación de masa molecular relativa y un límite de transmisión, y la columna cromatográfica tiene un límite superior y un límite inferior. El límite superior de la columna cromatográfica es que cuando el tamaño de la molécula más pequeña del polímero es mayor que el tamaño del gel más grande en la columna, el polímero no puede entrar en el tamaño de los poros de las partículas del gel y todo fluye desde el exterior. de las partículas de gel, lo que hace imposible separar polímeros con diferentes pesos moleculares relativos. Además, los poros del gel pueden obstruirse, afectando el efecto de separación de la columna cromatográfica y reduciendo su vida útil. El límite inferior de la columna cromatográfica es cuando la cadena molecular más grande del polímero es más pequeña que el tamaño de poro mínimo del poro del gel y no se puede lograr el propósito de separar diferentes pesos moleculares relativos. Por lo tanto, cuando se utiliza cromatografía en gel para determinar el peso molecular relativo, primero se debe seleccionar una columna cromatográfica que coincida con el rango de peso molecular relativo del polímero.
2.1.3. Rellenos (el requisito más básico para los rellenos es que no puedan disolverse con disolventes): gel de poliestireno reticulado (apto para disolventes orgánicos y resistencia a altas temperaturas), acetato de polivinilo reticulado. gel (hasta 100°C, adecuado para disolventes polares como etanol y acetona), bolas de silicona porosas (adecuadas para agua y disolventes orgánicos).
2.1.4. Pilar: vidrio, acero inoxidable.
2.1.5. Sistema de detección: Detector universal: adecuado para la detección de todos los polímeros y compuestos orgánicos. Existen detectores diferenciales de índice de refracción, detectores de absorción UV y detectores de viscosidad.
2.1.6. Detector refractómetro diferencial: El índice de refracción del disolvente debe ser lo más diferente posible del índice de refracción de la muestra a medir.
2.1.7. Detector de absorción ultravioleta: El disolvente no tiene una fuerte absorción cerca de la longitud de onda de absorción característica del soluto.
2.1.8. Detector selectivo: indicado para polímeros y compuestos orgánicos que tengan respuestas especiales al detector. Hay detectores de UV, IR, fluorescencia y conductividad.
2.2.Operación:
2.2.1.Selección de solvente: puede disolver varios polímeros; no puede corroer las piezas del instrumento;
2.2.2 Combinando la dispersión láser y la cromatografía en gel, se puede obtener el espectro de concentración y el espectro de cambio de la intensidad de la luz dispersa con la cantidad de disolución, calculando así la curva de distribución del peso molecular de toda la muestra y varios promedios. pesos moleculares.
2.2.3. En el experimento de dispersión de luz láser, la muestra debe estar estrictamente espolvoreada. El polvo en la solución producirá una fuerte dispersión de la luz e interferirá seriamente con la medición de la dispersión de la luz de la solución de polímero. La eliminación del polvo de la solución es clave para una dispersión exitosa de la luz. El primer paso es la eliminación del polvo con disolvente. El disolvente utilizado para preparar la muestra de prueba debe destilarse y filtrarse a través de una membrana de ultrafiltración de 0,2 μm antes de su uso. La solución preparada también debe filtrarse con una membrana de ultrafiltración de 0,2 μm. Además, los instrumentos utilizados en las pruebas, como jeringas, etc., deben empaparse en loción y enjuagarse con agua limpia antes de su uso.