Cómo ver mapas de plásmidos

1. El primer paso es observar las flechas:

La mayoría de los plásmidos tendrán flechas y hay dos interpretaciones de las flechas. Una es la dirección de la transcripción. La dirección de la transcripción es principalmente una gran flecha que comienza desde el promotor, que es la secuencia de la secuencia del promotor. El otro es la dirección del sitio de origen de la replicación. El sitio de origen de la replicación es la dirección de replicación del ADN del plásmido en bacterias u hongos como E. coli.

También cabe mencionar que el promotor F1 (f1 ori en la imagen) representa la dirección inicial de la replicación del fago. Sólo puede copiar ADN monocatenario, pero puede usarse para secuenciar. Comprenda la dirección de la transcripción para poder diseñar fácilmente la posición y la direccionalidad de los fragmentos insertados.

2. En el segundo paso, mira las etiquetas de arriba.

Gen reportero: Suelen utilizarse una o dos proteínas como genes reporteros, como por ejemplo el común copGFP (proteína verde fluorescente), Puro (puromicina), Lacz (operón lactosa), etc. A diferencia de los genes de resistencia, estos genes indicadores no están destinados a funcionar en el proceso de amplificación de plásmidos en E. coli.

Desempeña un papel después de que el plásmido se transfiere al sistema de expresión, básicamente para mostrar si el gen sobreexpresado o anulado está funcionando normalmente. Algunos genes indicadores se fusionarán en proteínas y se expresarán, y otros se expresarán utilizando un promotor independiente (como los plásmidos shRNA).

3. El tercer paso es mirar el sitio de clonación múltiple:

MCS (sitio de clonación múltiple, es decir, sitio de clonación múltiple), generalmente se enumerará el sitio de clonación múltiple. en la imagen Los sitios de restricción están marcados. La secuencia de sitios de restricción anterior generalmente está dispuesta en el orden de 5`-3`. Tenga en cuenta los siguientes puntos.

El primer punto es tener en cuenta que el * marcado junto al sitio de corte de la enzima generalmente significa que no hay un solo sitio y no se puede utilizar como sitio de corte de la enzima para construir plásmidos.

El segundo punto a tener en cuenta es que algunos sitios de escisión de enzimas solo tienen uno en la secuencia, pero también estará marcado con un * o (dam), lo que indica que este sitio de escisión de enzimas puede tener metilación. modificaciones de islas CpG [la más común es XbaI, el TC en TCTAG(6m)A no se puede cortar], y generalmente no se puede usar. Pero si debe utilizar este sitio de corte de enzimas, deberá utilizar células competentes no metiladas, como JM109 o JM110.

4. El cuarto paso es observar la secuencia del sitio de clonación múltiple:

Si hay diferencias en los extremos, puedes reemplazar el extremo 5′ del ATG ( metionina) del gen. 1-2 bases (conviértete en GTG o GCG), a partir de la segunda secuencia de aminoácidos pueden ser completamente idénticas. Cuando se combina con amplificación y digestión enzimática, se permite que el fragmento de inserción tenga redundancia en el extremo 3'.

Para hacer frente a las bases redundantes en el extremo 3`, hay un código TAA de parada de decodificación después de la secuencia del sitio de clonación múltiple. Incluso si el fragmento insertado causa una mutación por cambio de marco en el extremo 3`. La proteína expresada todavía se puede terminar normalmente (en los plásmidos AD de dos híbridos de levadura, dado que se inserta ADNc aleatorio, dicha estructura es común en los vectores AD).

Información ampliada

Clasificación

1. Según si los plásmidos pueden pasar la conjugación bacteriana, se pueden dividir en plásmidos conjugativos y plásmidos no conjugativos.

Los plásmidos conjugativos portan genes relacionados con la transmisión conjugativa. Los plásmidos no conjugativos se transmiten bajo ciertas condiciones mediante inducción o transducción de sus plásmidos conjugativos existentes.

2. Según el tipo de replicación del plásmido en las bacterias, se puede dividir en dos categorías: tipo de control estricto y tipo de control flexible.

El sistema enzimático de replicación del plásmido replicante está estrictamente controlado y es responsable de la replicación del ADN cromosómico. Sólo puede replicarse en una determinada etapa del ciclo celular cuando el cromosoma celular deja de replicarse, el plásmido. ya no se replicará.

El sistema replicasa de los plásmidos con control de replicación relajado no se ve afectado por el sistema replicasa del ADN cromosómico y puede replicarse en cualquier momento durante todo el ciclo de crecimiento celular. El plásmido puede continuar replicándose cuando la replicación cromosómica se ha detenido.

3. Según la incompatibilidad de los plásmidos, se puede dividir en incompatibilidad y compatibilidad.

La incompatibilidad se refiere al fenómeno de que plásmidos estructuralmente similares y estrechamente relacionados no pueden existir de manera estable en la misma bacteria huésped, y lo contrario es la compatibilidad. A menudo se utiliza en investigaciones epidemiológicas.

Referencia: Enciclopedia Baidu-Plásmido